徐佳佳，劉玉峰，孔凡華，喬子純，崔亞娟，徐錫媛，鄭曉瑋，李 東

（北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100069）

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharide，簡(jiǎn)稱IMO）以淀粉或淀粉質(zhì)原料，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化、精制、濃縮等工藝制得的一種淀粉糖產(chǎn)品，分子中至少含有一個(gè)葡萄糖分子間以α-1,6 糖苷鍵結(jié)合的異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖，以及其他四糖以上的低聚糖的總稱，是近些年發(fā)展速度較快的一種功能性低聚糖[1?6]。商品低聚異麥芽糖產(chǎn)品規(guī)格主要有兩種，IMO-50 型和IMO-90 型[7]。低聚異麥芽糖屬于非消化性低聚糖類，難以被胃酶消化，具有水溶性膳食纖維功能，其熱量低，基本上不增加血糖血脂，有助于維持腸道菌群平衡，改善腹瀉與便泌，預(yù)防齲齒，提高機(jī)體免疫力[8?10]。鑒于低聚異麥芽糖的特性和保健功能，其已被日益廣泛應(yīng)用于保健品、食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[11]。食品中加入低聚異麥芽糖對(duì)促進(jìn)人體健康具有重要意義，一定程度上降低肥胖、糖尿病、冠心病等癥的發(fā)病率。

糖類的檢測(cè)方法主要有比色法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]、色譜法[4,14?28]、滴定法[16]等。其中色譜技術(shù)是目前所廣泛應(yīng)用的檢測(cè)糖的方法。目前，低聚異麥芽糖的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[4,14?17]、氣相色譜法[18?19]、離子色譜法[20?28]等。高效液相色譜法受示差檢測(cè)器的影響，靈敏度較低；氣相色譜分離效果好，靈敏度高，但樣品前處理步驟復(fù)雜，一般需要對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，離子色譜法測(cè)定糖具有樣品前處理簡(jiǎn)單，無需衍生，且專一性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，其用于測(cè)定糖類逐漸被關(guān)注[29?32]。糖能夠在pH≥12 的堿性環(huán)境中解離成陰離子，在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)，用陰離子交換柱進(jìn)行分離后，可以用脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)[10]。本研究樣品經(jīng)水溶解提取，酸沉淀蛋白后，采用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器測(cè)定低聚異麥芽糖，以期為監(jiān)管政策的落實(shí)和實(shí)施提供必要的技術(shù)支持和有力保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異麥芽糖對(duì)照品（純度97.0%）東京化成工業(yè)株式會(huì)社；異麥芽三糖對(duì)照品（純度97.0%）東京化成工業(yè)株式會(huì)社；潘糖對(duì)照品（純度99.0%）、50%氫氧化鈉溶液（色譜純）Sigma公司;磺基水楊酸（優(yōu)級(jí)純）天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇（色譜純）

Fisher公司；ON GUARD ⅡRP柱（3cc）美國(guó)ThermoFisher公司；0.45 μm水系濾膜 天津津滕公司；實(shí)驗(yàn)室用水 Aquaplore 2C超純水；實(shí)驗(yàn)所需樣品 購(gòu)于北京各大超市。

ICS-3000 離子色譜儀 美國(guó)ThermoFisher公司，配脈沖安培檢測(cè)器金工作電極，Ag/AgCl參比電極；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ME235s電子天平 精度0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 9 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取50 mg（精確至0.1 mg）的異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖對(duì)照品到50 mL容量瓶中，用超純水配制成濃度約為1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置4 ℃密封可保存1 個(gè)月。

9 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確吸取9 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，為9 種糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。分別準(zhǔn)確吸取9 種糖使用溶液1、2、3、5、10、20 mL于50 mL容量瓶中，用水定容。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液濃度分別為0.8、1.6、2.4、4.0、8.0、16.0 mg/L，用時(shí)現(xiàn)配。

冰醋酸水溶液（0.05 mol/L）：準(zhǔn)確吸取600 μL冰醋酸于水中，用水定容至50 mL，混勻。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 采樣和試樣制備 固體樣品：抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過篩，混勻，裝入自封袋中，備用。

液體樣品：混勻，備用。

1.2.2.2 提取 稱取0.5～5.0 g（精確至0.001 g）的制備好的樣品于100 mL容量瓶中，加入80 ℃左右的熱水40 mL，超聲提取15 min，冷卻至室溫后，加入20 mL3%磺基水楊酸溶液并用水定容至100 mL，充分混勻后，靜置15 min。溶液經(jīng)濾紙過濾，濾液依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍確定稀釋倍數(shù)，備用。

1.2.2.3 凈化 凈化柱ON GUARD Ⅱ RP柱的活化按照以下步驟操作：將ON GUARD Ⅱ RP柱使用前依次用10 mL甲醇、15 mL超純水進(jìn)行活化，活化液體流速控制在3 mL/min，放平，靜置20 min后使用。

取上清液依次通過0.45 μm水相濾膜和凈化柱，棄去前面3 倍柱體積洗脫液，收集后面的洗脫液待測(cè)。

1.2.3 離子色譜條件 賽默飛CarboPacTM PA20色譜柱（4.0 mm×150 mm，10 μm），CarboPacTM PA20 保護(hù)柱（4.0 mm×50 mm，10 μm），流動(dòng)相：A為去離子水、B為200 mmol/L氫氧化鈉溶液；流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣體積：10 μL，柱溫:30 ℃（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜結(jié)果積分處理采用Thermo Chromenleon 6.8 SR14 色譜工作站，并利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

食品中基質(zhì)復(fù)雜，不僅會(huì)對(duì)目標(biāo)色譜峰產(chǎn)生干擾，而且容易對(duì)色譜柱及檢測(cè)器造成損壞。因此，樣品前處理過程中使用了凈化柱，目的是去除試樣溶液中的色素、少量的大分子物質(zhì)、脂類等，以保護(hù)分析柱，常用的凈化柱有ON GUARD A柱，ON GUARD Na柱，ON GUARD Ⅱ RP柱等。A柱主要用于去除樣品溶液中的陰離子污染物并中和強(qiáng)酸；Na柱主要用于去除樣品溶液中的金屬離子；RP柱主要用于去除樣品溶液中的疏水性物質(zhì)及表面活性劑[33]。考慮到樣品中可能存在部分脂溶性物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選用了ON GUARD Ⅱ RP柱，選取果粒飲料、西梅飲料、酵素、谷物棒、配方奶粉作為實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)ON GUARD ⅡRP柱對(duì)目標(biāo)物的回收率做了考察，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的平均回收率分別為99.31%、99.85%、99.54%，回收率均達(dá)99%以上，因此實(shí)驗(yàn)確定選用該凈化柱。

此外，在樣品前處理過程中增加除蛋白的步驟以減少對(duì)結(jié)果的干擾[33]。常見的除蛋白的方法有鹽析法[28]、有機(jī)試劑沉淀法[28,34]、沉淀劑法[35]、酸沉淀法[36?37]等。本實(shí)驗(yàn)從樣品類型、色譜柱、淋洗液等綜合因素考慮沉淀劑的選擇及適用性。鹽析法需加入大量鹽類物質(zhì)，上機(jī)前需對(duì)樣品溶液進(jìn)行脫鹽處理，否則高濃度的鹽易對(duì)色譜峰的峰形及保留時(shí)間造成影響。有機(jī)試劑沉淀法操作簡(jiǎn)單，沉淀蛋白的分辨能力高于鹽析法，但考慮到乙腈、乙醇等有機(jī)試劑揮發(fā)性較強(qiáng)，易對(duì)環(huán)境造成污染，故排除了有機(jī)試劑沉淀法。常用的蛋白沉淀劑有亞鐵氰化鉀-乙酸鋅，沉淀效率高，但考慮到金屬離子對(duì)離子色譜的不良影響，故不考慮沉淀劑法。綜上，本實(shí)驗(yàn)采用冰醋酸沉淀法，取6 份樣品，分別加入0.05 mol/L的冰醋酸水溶液1、2、3、4、5、6 mL，考察蛋白質(zhì)的沉淀情況，結(jié)果表明，加入5 mL0.05 mol/L的冰醋酸水溶液時(shí)，樣品中的蛋白質(zhì)完全沉淀，因此，確定加入5 mL 0.05 mol/L的冰醋酸水溶液作為蛋白沉淀劑，沉淀效果較好且對(duì)離子色譜分析無影響。

2.2 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)采用陰離子交換柱CarboPacTM PA1、PA20，比較兩種色譜柱對(duì)樣品中可能存在的半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的分離效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，色譜柱CarboPacTM PA20 樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合季銨基團(tuán)的乳膠比比色譜柱CarboPacTM PA1 小、分離速度適中，在170 mmol/L氫氧化鈉溶液濃度下，半乳糖、葡萄糖、果糖在色譜柱CarboPacTM PA20 能夠得到較好分離。色譜柱CarboPacTM PA1 也可以將9 種糖進(jìn)行分離，但分離效果較色譜柱CarboPacTM PA20差且分析時(shí)間長(zhǎng)，當(dāng)樣品中乳糖含量高時(shí)分離效果不理想，綜上，色譜柱CarboPacTM PA20 相較而言具有更大優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)采用色譜柱CarboPacTM PA20 進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。其中，色譜柱CarboPacTM PA20 色譜圖和色譜柱CarboPacTM PA1 色譜圖見圖1 和圖2。

圖1 CarboPacTM PA20 色譜柱色譜圖Fig.1 The chromatogramof CarboPacTM PA20 column

圖2 CarboPacTM PA1 色譜柱色譜圖Fig.2 The chromatogramof CarboPacTM PA1 column

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了不同濃度的氫氧化鈉溶液作為流動(dòng)相的色譜分離條件，結(jié)果表明，流動(dòng)相中氫氧化鈉溶液濃度的高低直接影響分離效果和分離時(shí)間，提高氫氧化鈉溶液的濃度能夠縮短出峰時(shí)間，但是可能造成分離度下降，降低氫氧化鈉溶液濃度可以增加分離度，同時(shí)使分離時(shí)間延長(zhǎng)，難以在較短的時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)物得到較好的分離度，且半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等洗脫需要的氫氧化鈉溶液較異麥芽三糖、潘糖洗脫需要的氫氧化鈉溶液低，綜合以上因素考慮，采用梯度洗脫的方式，分離度和分離時(shí)間結(jié)果滿意，樣品測(cè)定效果較好。當(dāng)樣品中乳糖含量較高時(shí)，可以通過酶解法酶解乳糖或者調(diào)整梯度洗脫程序使異麥芽糖和乳糖實(shí)現(xiàn)較好的分離，樣品色譜圖如圖3 所示，酶解乳糖后產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖，樣品色譜圖如圖4所示。

圖3 樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of sample

圖4 樣品色譜圖Fig.4 The chromatogram of sample

2.4 方法線性回歸方程

以目標(biāo)物質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖在0.8～16.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各化合物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 3 個(gè)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients of the three compounds

2.5 方法的定量限

當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，將異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的色譜信號(hào)峰與基線信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比約為10 的濃度進(jìn)行定量限計(jì)算，得異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的定量限均為0.01 g/100 g。

2.6 精密度的測(cè)定

平行稱取6 份果味飲料，按照前處理方法進(jìn)行提取并上機(jī)測(cè)定。結(jié)果如表3 所示，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.42%、2.34%、1.11%，均小于5%，精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（g/100 g）Table 3 The results of precision (g/100 g)

2.7 回收率的測(cè)定

平行準(zhǔn)確稱取6 份果味飲料，按照樣品前處理方法進(jìn)行提取并上機(jī)測(cè)定，取六次測(cè)定結(jié)果的平均值為目標(biāo)物的本底值；準(zhǔn)確稱取9 份1 g（精確至0.0001 g）果味飲料分別加入不同量的低聚異麥芽糖，按照樣品前處理方法進(jìn)行提取并上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，三種低聚異麥芽糖的回收率在85.63%～105.22%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.48%～4.49%之間，方法回收率良好，準(zhǔn)確度較高。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of recovery

回收率公式如下：P=（X1?X0）/ m×100

式中，P：加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率；m：加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量；X1：加標(biāo)試樣的測(cè)定值；X0：本底的測(cè)定值。

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)共收集了果味固體飲料（飲料1）、西梅飲料（飲料2）、果粒飲料（飲料3）、乳酸菌飲料（飲料4）、保健果茶、蜂蜜、酵素、果凍、營(yíng)養(yǎng)奶昔、功能食鹽、蘇打餅干、谷物棒、配方奶粉等13 種不同類型的產(chǎn)品，按照已建立的方法測(cè)定樣品中6 種單雙糖和三種低聚異麥芽糖的含量，結(jié)果見表5。該方法操作簡(jiǎn)單，可行性好，專一性強(qiáng)，適合不同類型食品中低聚異麥芽糖的測(cè)定。

表5 不同食品中糖的含量（g/100 g）Table 5 Sugars concentration detected in different of foods（g/100 g）

3 結(jié)論

本文用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定食品中半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖，并對(duì)樣品的前處理及色譜柱和流動(dòng)相的選擇進(jìn)行了考察和優(yōu)化、確定了梯度洗脫程序，使其可用于多種類型的食品中的九種糖的檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法在0.8～16.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖精密度RSD分別為3.42%、2.34%、1.11%，回收率在85.63%～105.22%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.48%～4.49%之間。方法前處理簡(jiǎn)單、分離效果好、專一性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確度高、精密度好。該方法可以為測(cè)定多種類型食品中的低聚異麥芽糖的檢測(cè)提供較為準(zhǔn)確、可靠的分析方法，為監(jiān)管政策的落實(shí)和實(shí)施提供必要的技術(shù)支持和有力保障，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。