徐順連，周加本，馬維博，陳 志

(1.青海師范大學(xué)，青海 西寧 810008；2.河北工業(yè)大學(xué)，河北 石家莊 300401)

川貝母，主要是指川貝母(Fritillariaecirrhosae(CB-Fc)，暗紫貝母(Fritillariaeunibracteata(CB-Fun))和貝母(Fritillariaeprzewalskii(CB-Fp))植物的干燥球莖，是四川省地理特色的原料藥材之一[1]。其干燥鱗莖具有化痰止咳、清熱潤(rùn)肺、散結(jié)消癰的功能，主治干咳少痰、咯痰帶血、陰虛勞咳等癥，廣泛用于中藥方劑及中成藥中[2]。生于海拔3 000～4 000 m山坡草叢或陰濕的小灌木叢中[3]。生物堿是川貝母的特征性成分[4]，其甾體生物堿是川貝母的主要活性成分[5]。由于川貝母中的大部分生物堿都不含生色團(tuán)，當(dāng)用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，紫外吸收很弱，所以王麗芝等人通常采用HPLC-ELSD的方法，同時(shí)檢測(cè)川貝母藥材中4種生物堿(貝母辛、西貝素、貝母素甲和貝母素乙)[6]。但是采用以上方法檢測(cè)貝母屬植物中其他生物堿時(shí)，會(huì)出現(xiàn)貝母素甲和貝母素乙含量都較低，未檢測(cè)到西貝母堿等情況[7～9]。因此，本文主要采用柱前紫外衍生的方法對(duì)川貝母中的生物堿貝母素甲進(jìn)行檢測(cè)，這為川貝母中其他生物堿的檢測(cè)方法提供了借鑒和參考。

1 儀器試藥

島津高效液相色譜儀(LC-20AT) 色譜柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)，SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器 KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，沃特浦超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，電子恒溫水浴鍋(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)。貝母素甲對(duì)照品(純度99% ，北京諾禾致源科技股份有限公司)，對(duì)甲苯磺酰氯(純度98%阿拉丁科技有限公司 批號(hào)：A2010137)，甲酸(純度為99.0%，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng))，水為去離子水，甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇—水(60∶40，V∶V)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱(chēng)取20 mg貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)品于100 ml的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線(xiàn)。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取500 mg樣品，加入1 ml氨水浸潤(rùn)1 h，隨后加入10 ml三氯甲烷：甲醇=4∶1，加熱回流處理2 h；取出5 ml濃縮熱干，加入500 μL甲醇復(fù)溶，待用。

2.2.3 衍生試劑的制備 精密稱(chēng)取400 mg的對(duì)甲苯磺酰氯于100 ml的容量瓶中，充分振蕩搖勻，用乙腈定容至刻度線(xiàn)。

2.2.4 衍生反應(yīng)的過(guò)程 取川貝母提取液1 ml于25 ml的圓底燒瓶中，加入2 ml的衍生試劑，然后在70℃的水浴鍋上加熱回流1 h時(shí)冷卻至室溫，取1.5 ml于安培瓶中，按2.1 的色譜條件測(cè)定產(chǎn)物的峰面積。

3 色譜條件

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 使用DAD紫外檢測(cè)器對(duì)衍生劑和衍生產(chǎn)物分別進(jìn)行掃描，在200～400 nm的范圍內(nèi)，衍生產(chǎn)物在240 nm處有最大吸收峰，而對(duì)甲苯磺酰氯在該處無(wú)吸收，故選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 以甲醇—水作為流動(dòng)相，考察不同體積比的甲醇—水對(duì)衍生產(chǎn)物分離的影響。結(jié)果表明：隨著甲醇含量的增加，保留時(shí)間縮短，當(dāng)甲醇含量在60%時(shí)，峰形良好。綜合考慮，選定甲醇—水(60∶40，v/v)(2/1 000的甲酸)作為流動(dòng)相。

3.1.3 流速的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同流速(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml/min)對(duì)衍生產(chǎn)物分離的影響。隨著流速的增加，保留時(shí)間縮短，峰形較好。 綜合考慮分析時(shí)間、分離效率等因素，確定流速為1.00 ml/min。

3.1.4 柱溫的選擇 在其他色譜條件不變的情況下，實(shí)驗(yàn)考查了不同柱溫(30℃～40℃)對(duì)衍生產(chǎn)物分離的影響。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，貝母素甲的衍生物色譜峰的保留時(shí)間縮短，峰面積增加，但出現(xiàn)峰展寬。綜合考慮分析時(shí)間、分離效率等因素，確定柱溫為35℃。

3.2 衍生反應(yīng)條件的確定

3.2.1 衍生時(shí)間 當(dāng)衍生反應(yīng)的溫度為70℃時(shí)，分別試驗(yàn)時(shí)間為40、45、50、55、60、65 min對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在60 min后，衍生反應(yīng)完全，故確定衍生時(shí)間為60 min，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 貝母素甲衍生產(chǎn)物峰面積與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系

3.2.2 衍生溫度 取貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml于圓底燒瓶中，再加入2 ml的衍生試劑，平行操作6次，分別于50、55、60、65、70、75℃的水浴鍋中反應(yīng)，分別反應(yīng)60 min后冷卻至室溫，按2.1的色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見(jiàn)圖2，反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積在70℃時(shí)達(dá)到最大。

圖2 貝母素甲衍生產(chǎn)物峰面積與反應(yīng)溫度的關(guān)系

3.2.3 衍生劑的用量 當(dāng)衍生反應(yīng)溫度為70℃、衍生反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，分別試驗(yàn)衍生劑的用量為反應(yīng)物的1.4、1.6、1.8、2.0、2.2倍時(shí)，對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響，結(jié)果表明，峰面積在2倍時(shí)達(dá)到了最大值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 貝母素甲衍生產(chǎn)物的峰面積與衍生劑用量的關(guān)系

3.3 方法性能指標(biāo)

3.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取1 ml的樣品溶液于圓底燒瓶中，再加入2 ml的衍生試劑，然后按照2.2.4的操作步驟進(jìn)行衍生后，用2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果圖4、5，衍生試劑對(duì)衍生產(chǎn)物無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好。

圖4 川貝母生物堿貝母素甲衍生后的HPLC

圖5 衍生試劑的HPLC

3.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 線(xiàn)性范圍和檢出限以保留時(shí)間定性，峰面積定量，貝母素甲在0.05～2.50 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，經(jīng)線(xiàn)性回歸，得回歸方程為y=2E+06x+3E+06，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9993。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 將川貝母提取液按照2.2.4的衍生條件進(jìn)行衍生，按照2.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD=2.4%。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2.2的操作步驟制備6份提取液，按照2.2.4的衍生條件進(jìn)行衍生，按照2.1的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD=2.7%。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將川貝母中的貝母素甲衍生后，分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，RSD=2.4%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 在實(shí)際樣品中加入不同濃度的貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.4進(jìn)行衍生，按2.1的色譜條件進(jìn)行進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)如下表，由表可見(jiàn)，加標(biāo)回收率的范圍在95.67%～100%。

貝母素甲的加樣回收率試驗(yàn)

3.4 樣品含量測(cè)定

取川貝母生物堿樣品，按上述制備方法和衍生條件反應(yīng)后，測(cè)定川貝母中貝母素甲衍生產(chǎn)物峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算貝母素甲的含量，結(jié)果表明，樣品中貝母素甲的含量為3.14%。