李美雎，劉 葉，尚 軍，陳海娟

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

羌活(Notopterygiumincisum)的主要藥效成份是揮發(fā)油和香豆素類，李兆奎等[1]運(yùn)用紅外光譜方法對(duì)鐵皮石斛和幾種常用的混淆品進(jìn)行了對(duì)比分析，可以迅速、準(zhǔn)確的將幾種藥品區(qū)分開(kāi)。劉明地等[2]采用紅外光譜法對(duì)枸杞藥材進(jìn)行測(cè)定質(zhì)量。陳燕等[3]為了提高羌活的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用高效液相色譜測(cè)定分析；吳方斌等[4]用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)測(cè)定羌活、寬葉羌活的根莖和根藥材的一維紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜，通過(guò)計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)光譜，定量測(cè)定峰的強(qiáng)度，并進(jìn)行光譜解析、主成分分析快速鑒別羌活和寬葉羌活兩種基原植物藥材，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羌活與寬葉羌活一維紅外光譜的特征峰不同，可鑒別羌活和寬葉羌活。沈亮等[5]測(cè)定羌活種子在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰，然后將紅外光譜法與SIMCA模式識(shí)別法和系統(tǒng)聚類法相結(jié)合并快速、準(zhǔn)確地將羌活種子鑒別出來(lái)。羌活喜涼爽陰濕、耐寒、怕強(qiáng)光，適于寒冷濕潤(rùn)氣候，青海省的海東地區(qū)(主要是化隆縣、互助縣柏門峽、循化縣、民和縣、大通縣)，果洛州(主要是久治、達(dá)日、班瑪縣和瑪可河、軍工地區(qū))等地均有羌活和寬葉羌活分布[6，7]。紅外光譜已經(jīng)成為了中藥化學(xué)成分組成、結(jié)構(gòu)、含量研究的重要方法，是中成藥、中藥炮制、中藥材鑒別分析的有效手段，在中藥定量檢驗(yàn)及定性鑒別中的應(yīng)用價(jià)值得到公認(rèn)。目前，關(guān)于青海不同產(chǎn)地羌活紅外指紋圖譜構(gòu)建尚未報(bào)道。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司Spectrum Two。

電子天平METTLER TOLEDO(XP205 DeltaRange)。

YP-2壓片機(jī) 上海山岳科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 藥品與藥材 溴化鉀(KBr，光譜純)碎晶購(gòu)于天津博君科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用羌活采挖于青海省互助、瑪可河、紅軍溝、久治、松多、大通、班瑪?shù)鹊厍揖?jīng)尚軍副教授鑒定；羌活對(duì)照藥材采購(gòu)于九康中藥市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將樣品進(jìn)行粉碎、研磨，過(guò)150目篩，放置烘箱中60 ℃恒溫干燥至恒重，將樣品粉末與溴化鉀碎晶進(jìn)行制品 ，溴化鉀空白片作為對(duì)照。

1.2.2 儀器測(cè)試條件 一維紅外光譜的掃描范圍為4 000～400 cm-1，每張光譜累加掃描64次，分辨率為4 cm-1，掃描過(guò)程中實(shí)時(shí)扣除二氧化碳和水蒸氣干擾。

1.2.3 精密度的測(cè)定 將采于互助北山的樣品連續(xù)測(cè)定5次，所得紅外光譜圖的相關(guān)系數(shù)為0.999，RSD值為0.000%，表明儀器精密度良好。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 將采于互助北山的樣品，按供試品制備方法平行制備5份，分別測(cè)定，所得紅外光譜圖的相關(guān)系數(shù)為0.962，RSD值為2.390%，表明方法重復(fù)性良好。

1.2.5 紅外光譜的測(cè)定 先將溴化鉀空白片置于紅外光譜儀中，掃描，得空白背景片的一維紅外光譜。再將樣品片置于紅外光譜儀中，掃描，得到樣品片的一維紅外光譜。

1.2.6 一維紅外光譜的歸一化 將樣品收集得到的一維紅外光譜經(jīng)坐標(biāo)轉(zhuǎn)化(縱坐標(biāo)為吸光度)，基線校正，光譜歸一化，得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜。儀器自動(dòng)識(shí)別峰的閾值設(shè)為0.01 A(峰強(qiáng))。

1.2.7 二階導(dǎo)數(shù)光譜計(jì)算 對(duì)已歸一化的一維紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算，13點(diǎn)平滑，即得二階導(dǎo)數(shù)光譜。儀器自動(dòng)識(shí)別峰的閾值設(shè)為0.0005 A(峰強(qiáng))。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地羌活一維譜及相關(guān)性分析

由表1可知，久治產(chǎn)羌活與紅軍溝、大通產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)系數(shù)在0.900以上，與其他地方產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下；紅軍溝產(chǎn)羌活與瑪可河、班瑪產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下，與其他地方產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)系數(shù)在0.900以上；大通產(chǎn)羌活與瑪可河、班瑪產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下，與其他地方羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)系數(shù)在0.900以上；瑪可河產(chǎn)羌活與其他地方的羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下；松多產(chǎn)羌活與久治、瑪可河、班瑪產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下，與其他地方的羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)系數(shù)在0.900以上；互助產(chǎn)羌活與久治、瑪可河、班瑪產(chǎn)羌活相比化學(xué)成分差異較大，相關(guān)系數(shù)在0.900以下，與其他地方的羌活相比化學(xué)成分差異較小，相關(guān)系數(shù)在0.900以上。

表1 青海不同產(chǎn)地羌活相關(guān)系數(shù)測(cè)定結(jié)果

不同產(chǎn)地羌活植物的一維紅外光譜相似，主要吸收峰位于3 424～3 392、2 928～2 925、2 857～2 854、1 747～1 737、1 628～1 627、1 516～1 513、1 460～1 428、1 378、1 268～1 257、1 157、1 072～1 031、773、576～529、472 cm-1等處(圖1)。其中，3 424～3 392 cm-1為羥基伸縮振動(dòng)吸收峰；2 928～2 925 cm-1為亞甲基C-H反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；2 857～2 854 cm-1為亞甲基C-H對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸峰；1 747～1 737 cm-1為酯羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰；1 628～1 627 cm-1為C=O或C=C伸縮振動(dòng)吸收峰(包括由蛋白質(zhì)中C=O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的酰胺Ⅰ帶)；1 516～1 513 cm-1為苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰；1 460～1 428和1 378 cm-1可能為C-H彎曲振動(dòng)吸峰；1 268～1257、1 157、1 072～1 031 cm-1為C-O伸縮振動(dòng)吸收峰；950 cm-1以下為苯環(huán)的骨架振動(dòng)峰。

圖1 羌活一維疊加圖

2.2 不同產(chǎn)地羌活二階導(dǎo)數(shù)光譜的比較

由于在1 800 cm-1之前會(huì)受-OH的影響，而800 cm-1之后基線漂移過(guò)大，故選擇1 800～800 cm-1范圍內(nèi)的羌活(如圖2)進(jìn)行分析。在羌活二階導(dǎo)數(shù)光譜中使用垂直光標(biāo)標(biāo)記，顯示1 746、1 628、1 605、1 580、1 545、1 515、1 469、1 457、1 446、1 157、1 130、1 076、988 cm-1是幾個(gè)地方羌活的共同峰。

圖2 羌活植物的二階導(dǎo)數(shù)疊加圖

2.3 羌活主成分分析

將羌活一維紅外光譜經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)換、基線校正及歸一化后，以吸光度為量化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。

由于3 400～2 800 cm-1波數(shù)處受測(cè)試環(huán)境水分的影響較大，缺乏特征性，而800～400 cm-1波數(shù)處基線不穩(wěn)，也缺乏特征性。故選取紅外光譜測(cè)試中特征表達(dá)穩(wěn)定的1 800～800 cm-1波數(shù)處作為羌活主成分分析特征波數(shù)區(qū)間，選取不同產(chǎn)地的羌活紅外一維譜在1 741、1 628、1 516、1 453、1 377、1 265、1 037 cm-1的7個(gè)共有峰，以吸光度為指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。其KMO值為0.7，p=0.00，說(shuō)明所選7個(gè)共有峰適宜做主成分分析，結(jié)果如表2，第一主成分累計(jì)方差為90.579%，第二主成分累計(jì)方差為6.955%，說(shuō)明前兩個(gè)主成分即可解釋7個(gè)紅外吸收峰變異的97.534%，即前兩個(gè)主成分可以利用資料量的97.534%；經(jīng)旋轉(zhuǎn)成分矩陣計(jì)算因子最終的得分后，進(jìn)一步計(jì)算各產(chǎn)地羌活化學(xué)成分累積量綜合得分，結(jié)果如表3所示，不同產(chǎn)地羌活累積化學(xué)成分含量具有明顯差異，其特征表現(xiàn)為班瑪羌活>羌活對(duì)照藥材>紅軍溝羌活>瑪可河羌活>大通羌活>久治羌活>互助羌活>松多羌活。

表2 解釋的總方差

圖3 旋轉(zhuǎn)空間中的成分圖

表3 成分因子得分變量

2.4 聚類分析

將羌活一維紅外光譜經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)換、基線校正及歸一化后，以吸光度為量化指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。

羌活樣品的主要吸收峰共6個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即相對(duì)應(yīng)的吸收峰A值，SPSS17.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。從系統(tǒng)聚類分析圖可以看出，可以將青海不同產(chǎn)地羌活分為兩大類，久治、互助、大通、松多、瑪可河產(chǎn)的歸為一類，紅軍溝、班瑪產(chǎn)的歸為一類。

圖4 不同產(chǎn)地羌活聚類分析圖

3 討論

通過(guò)紅外光譜技術(shù)測(cè)定化合物在4 000～400 cm-1的特征吸收峰對(duì)其進(jìn)行定性分析，紅外吸收峰吸光度的高低反應(yīng)了含量高低。由于中藥材產(chǎn)地不同，其次生代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類型及有效成分含量方面均存在一定的差異性，通過(guò)測(cè)定中藥材紅外指紋圖譜，在宏觀上可反應(yīng)中藥化學(xué)成分類型及相互關(guān)系，并通過(guò)不同產(chǎn)地間中藥材一維紅外指紋圖譜及二階導(dǎo)數(shù)光譜的峰形、出峰位置及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，找出相互間的關(guān)系，所建圖譜指紋性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度強(qiáng)。在一維紅外圖譜的基礎(chǔ)上，經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)化、基線校正和歸一化，由于在1 800 cm-1之前會(huì)受-OH的影響，而800 cm-1之后基線漂移過(guò)大，選擇1 800～800 cm-1范圍進(jìn)行分析，以特征峰吸光度為量化指標(biāo)，選擇特征性強(qiáng)的共有特征峰進(jìn)行主成分分析和聚類分析，評(píng)定中藥材化學(xué)成分累積量，建立以中藥材化學(xué)物質(zhì)為基礎(chǔ)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及不同產(chǎn)地間中藥材的化學(xué)成分累積量品質(zhì)關(guān)系評(píng)價(jià)。

但由于中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，藥理活性物質(zhì)基礎(chǔ)不明，僅建立以化學(xué)物質(zhì)為特征的指紋圖譜，還無(wú)法滿足中藥材“譜—效”關(guān)系的質(zhì)量控制要求。

目前，現(xiàn)行2015版《中華人民共和國(guó)藥典》羌活項(xiàng)下收載品種有羌活和寬葉羌活，其質(zhì)量控制指標(biāo)以測(cè)定羌活醇、阿魏酸苯乙醇酯、異歐前胡素及鐮葉芹二醇含量為其指控標(biāo)準(zhǔn)，并規(guī)定羌活醇和異歐前胡素的總量不得少于0.40%，而對(duì)二者之間的含量變化關(guān)系未作要求。實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建青海7個(gè)產(chǎn)地羌活整體紅外指紋圖譜，定性定量的分析了青海7個(gè)不同產(chǎn)地羌活品質(zhì)及相互關(guān)系。結(jié)果表明：7個(gè)產(chǎn)地的羌活樣品中有7個(gè)共有峰，化學(xué)成分累積量從高到低依次為班瑪、紅軍溝、瑪可河、大通、久治、互助、松多產(chǎn)羌活，且不同產(chǎn)地的羌活一維紅外圖譜及二階導(dǎo)數(shù)光譜均存在一定差異，說(shuō)明青海7個(gè)不同產(chǎn)地羌活所含化學(xué)成分的種類及含量存在一定差異，且即便是化學(xué)成分類型相似，但化學(xué)成分累積量也存在一定差異，進(jìn)而影響其品質(zhì)的差異。通過(guò)紅外光譜一維和二階導(dǎo)數(shù)圖光譜的構(gòu)建，結(jié)合主成分分析與聚類分析可以定量、定性對(duì)羌活進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)。