于紅妍，侯秀敏，唐炳明

(青海省草原總站，青海 西寧 810008)

蛇床子素(Osthole)是從蛇床(Cnidiummonnieri)、歐前胡(Peucedanumostruthium)等傳統(tǒng)中草藥中提取的香豆素類化合物，對多種鱗翅目害蟲、同翅目害蟲均有良好的防治效果，具有高效、低毒和低殘留等特點，為我國首創(chuàng)的新型高效環(huán)保生物農(nóng)藥[1]。目前，對蛇床子素的測定研究多集中在中藥常規(guī)質(zhì)量控制、天然提取物及生物試樣等方面[2～5]，圍繞青藏高原高寒牧區(qū)蛇床子素在防控草原蟲害后牧草和土壤中殘留分析的研究尚未見報道。因此，有必要對防控蟲害后的牧草和土壤中蛇床子素的農(nóng)藥殘留量進行快速、準確地測定，為其科學合理使用提供依據(jù)，以便達到生物防控安全有效的目的。本研究利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對高寒牧區(qū)防控蟲害后牧草及土壤中蛇床子素殘留量進行了快速分析，以期為高寒牧區(qū)防控草原蟲害藥劑的篩選提供科學依據(jù)。為了了解它的行為環(huán)境，本文對其殘留進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1260 Imifity ll -Agilent64700三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，電噴霧ESI，色譜柱Zorbax SB-C18，Narrow Bore RR100×2.1 mm，3.5 μm。梅特勒-托利多MS205DU精密電子天平。

1.1.2 測試樣品 2020年8月20日土壤和牧草樣品采集于青海省海北州祁連縣央隆鄉(xiāng)，直升飛機施藥防控草原蝗蟲區(qū)域，采用“Z”字形取樣法采集土壤和牧草樣品，取土深度0～10 cm，4分法采集500 g放于自封袋中并寫明標簽，采集牧草樣品，-20 ℃條件下保存待測。

蛇床子素標準儲備溶液：0.025 mL，用乙腈-水(3+2)10 mL。

蛇床子素標準品(純度為98%以上，批號：110822-201710)，甲醇、丙酮為色譜純，二氯甲烷、正己烷為分析純，試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱(100×2.1mm，i.d. 3.5μm)；柱溫30 ℃；液相流速0.2 mL/min；進樣量1 μL；流動相：水(含0.1%甲酸)—乙腈(含0.1%甲酸)：0min，10%乙腈；3～6 min，70%乙腈；9～14 min，95%乙腈；14.01～20 min，10%乙腈。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，正離子模式，霧化氣為氮氣，霧化氣壓力20 psi，離子噴霧電壓4 000 V，干燥氣溫度325 ℃ ，干燥氣流量10 L/min，鞘氣溫度400 ℃ ，鞘氣流速11 L/min，檢測方式：MRM。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 稱取粉碎的草樣5 g于80 mL離心管中，加入甲醇40 mL乙腈，用勻漿機15 000 r/min，勻漿2 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 mL在4000 r/min，離心5 min，取上清液20 mL，在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 mL，待凈化。在Spe-Pak Vac柱中加入約2 cm無水硫酸鈉，加樣前用4 mL乙腈+甲苯(3+1)預洗柱，當液面到達硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，并更換新接收瓶接收，再每次用2 mL乙腈+甲苯(3+1)洗滌樣液瓶3次，并將洗滌液移入柱中，用25 mL乙腈+甲苯(3+1)洗滌農(nóng)藥及相關(guān)化學品，合并于接收瓶中，并在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，氮吹儀上吹干，迅速加入5 mL乙腈+水(3+2)，混勻，過0.22 μm濾膜過濾后，待測。

1.3.2 高分辨質(zhì)譜定性與紫外峰面積外標法定量 采用液相色譜保留時間與高分辨質(zhì)譜進行定性，在選定的色譜條件下，蛇床子素的保留時間為9.88 min，以分子離子峰與碎片峰進行結(jié)構(gòu)確證。采用紫外峰面積外標法進行定量，然后進行RRLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果分析

由圖1a，圖1b可知，空白的響應值很低，對樣品檢測沒有影響。根據(jù)圖2a，圖2b選擇189.1為定量離子峰，由圖3a-圖5b可見，對三個樣品的測定均未檢出蛇床子素。通過對比圖2b和圖6b發(fā)現(xiàn)加標回收率較低，以處理好的樣品為溶劑配制標準品得到基質(zhì)標，由圖7，圖8發(fā)現(xiàn)樣品的基質(zhì)效應很強，這也是加標回收率較低的原因。

圖1a 空白多反應監(jiān)測總離子流圖

圖1b 空白質(zhì)譜圖

圖2a 標準品多反應監(jiān)測總離子流圖

圖2b 標準品質(zhì)譜圖

圖3a 樣1多反應監(jiān)測總離子流圖

圖3b 樣1質(zhì)譜圖

圖4a 樣2多反應監(jiān)測總離子流圖

圖4b 樣2質(zhì)譜圖

圖5a 樣3多反應監(jiān)測掃描圖

圖5b 樣3多反應監(jiān)測總離子流圖

圖6a 樣品加標多反應監(jiān)測總離子流圖

圖6b 樣品加標質(zhì)譜圖

圖7 基質(zhì)標多反應監(jiān)測總離子流圖

圖8 基質(zhì)標質(zhì)譜圖

2.2 標準曲線

參照文獻[6]中的方法，進行方法的線性及靈敏度評價，將0.025 mg/mL的蛇床子素標準儲備溶液用乙腈+水(3+2)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.00，10.00，100.00 ng/mL的標準溶液。以蛇床子素的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應的峰面積響應值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明：蛇床子素的質(zhì)量濃度在0.01～0.50 ng/mL與相對應的色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=5 215.7395x+0.00E，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。詳見圖9。

圖9 蛇床子素標準曲線

2.3 回收率測定結(jié)果

結(jié)果表明：土樣中回收率為97.34%～97.40%，精密度為8.31%，在牧草中的回收率為85.34%，回收率、精密度符合檢測要求，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 蛇床子素在牧草和土壤中加標回收率測定結(jié)果

2.4 方法的最小檢出量和最低檢測質(zhì)量分數(shù)

儀器對蛇床子素標準品最小檢出量為5 ng，方法對土壤中蛇床子素殘留最低檢測質(zhì)量分數(shù)均為0.2 μg/kg，牧草樣未檢出。詳見表2。

表2 蛇床子素在牧草和土壤中殘留測定結(jié)果

3 討論

本研究首次建立了一種測定牧草和土壤中蛇床子素殘留的液質(zhì)聯(lián)用分析方法。該方法對土壤中蛇床子素的最小檢出量為5 ng，蛇床子素在土壤中的平均回收率為97.34%～97.40%；在牧草中的回收率85.34%，所建立的方法靈敏度、準確度、精密度和重現(xiàn)性等方面均能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，實現(xiàn)本研究預期目標，為高寒牧區(qū)草原蟲害的安全、有效防控提供了可靠、準確的分析方法和科學依據(jù)。