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        基于DNA條形碼的四川老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)尺蛾科昆蟲(chóng)種類(lèi)鑒定

        2021-07-23 09:55:38王紅梅張雪蓮王磊岳碧松馮盛林陳本平孟楊
        四川動(dòng)物 2021年4期
        關(guān)鍵詞:尺蛾條形碼昆蟲(chóng)

        王紅梅, 張雪蓮, 王磊, 岳碧松, 馮盛林, 陳本平, 孟楊, 2*

        (1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610065; 2. 四川大學(xué)自然博物館,成都610065; 3. 四川省屏山縣老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,四川屏山645350)

        昆蟲(chóng)是種類(lèi)最多的動(dòng)物類(lèi)群,同時(shí)也對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能和全球經(jīng)濟(jì)有著重要作用(師丹,2009)。在生態(tài)系統(tǒng)中,昆蟲(chóng)往往與其他生物相互依存,尤其是鳥(niǎo)類(lèi)和植物(欒天宇,2017)。在保護(hù)區(qū)中昆蟲(chóng)作為生物資源的重要組成部分,了解其本底對(duì)于保護(hù)區(qū)的資源利用和生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面都具有重要意義(查玉平,2005)。四川老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是以保護(hù)四川山鷓鴣Arborophilarufipectus、白腹錦雞Chrysolophusamherstiae、白鷴Lophuranycthemera和紅腹角雉Tragopantemminckii等雉科Phasianidae鳥(niǎo)類(lèi),以及其伴生的珍稀野生動(dòng)植物和亞熱帶闊葉林生態(tài)系統(tǒng)為目的的森林和野生動(dòng)物類(lèi)型自然保護(hù)區(qū)。保護(hù)區(qū)內(nèi)生物資源豐富,植物、獸類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的生物資源都經(jīng)過(guò)了較為詳細(xì)的調(diào)查(楊杰等,2007;廖文波,2010;伍自力等,2015;何云玲等,2016),但尺蛾科Geometridae昆蟲(chóng)作為生物資源的組成部分還未經(jīng)過(guò)詳細(xì)調(diào)查。

        尺蛾科Geometridae隸屬于鱗翅目Lepidoptera尺蛾總科Geometroidea。尺蛾科是鱗翅目的第二大科,目前已描述的尺蛾接近23 000種,分布在除少數(shù)極地地區(qū)外的世界各地(Scoble & Hausmann,2007)。中國(guó)尺蛾科昆蟲(chóng)種類(lèi)十分豐富,目前已記載了3 800種以上(姜楠,2013)。尺蛾多以樹(shù)木為食,在森林生態(tài)系統(tǒng)中多樣性較高,對(duì)環(huán)境變化非常敏感,可作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)(韓紅香,2005;班曉雙,2017)。

        Hebert等(2003a,2003b)對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門(mén)的13 320個(gè)物種線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因近5’端一段長(zhǎng)度為658 bp的片段比對(duì)研究,發(fā)現(xiàn)這段序列相對(duì)保守又具有高變異性,認(rèn)為該基因片段可以用于物種鑒定,并提出了DNA條形碼技術(shù)。DNA條形碼是一段相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段,DNA條形碼技術(shù)通過(guò)對(duì)這一段相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的基因片段測(cè)序分析后,進(jìn)行個(gè)體物種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育研究、隱存種和新種發(fā)現(xiàn)等分析研究(Hebertetal.,2004a;Parketal.,2011;Chestersetal.,2012)。目前DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲(chóng)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物等類(lèi)群的物種鑒定中(Hebertetal.,2004b;宋韶彬等,2014;Caietal.,2016;楊瑞生等,2017;Liuetal.,2018)。在昆蟲(chóng)的分子鑒定中,目前被廣泛接受的分子標(biāo)記是COⅠ基因。

        本研究基于DNA條形碼技術(shù)分析保護(hù)區(qū)燈誘采集的尺蛾科昆蟲(chóng)資源,為保護(hù)區(qū)尺蛾科昆蟲(chóng)資源提供相關(guān)資料,同時(shí)為其資源利用與管理提供依據(jù)。

        1 研究地概況

        四川老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于四川盆地南緣宜賓市屏山縣境內(nèi)中部,屬于涼山山系,東西長(zhǎng)約11.6 km,南北寬約7.4 km,總面積約為35 km2,海拔800~2 008.7 m。該地區(qū)屬亞熱帶溫潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū),四季分明,雨量充沛,雨熱同季,年均氣溫12~14.7 ℃,年平均變幅小,年均濕度在85%以上,7—10月多在88%~92%(楊杰等,2007)。植被以闊葉林為主,包括亞熱帶常綠闊葉林和亞熱帶山地常綠、落葉闊葉混交林,海拔1 500 m以上分布了大面積原始常綠闊葉林,人為干擾較少,海拔1 500 m以下主要分布次生林和一定面積的人工林,人為干擾較大(西麗媛子等,2020)。

        2 材料和方法

        2.1 樣本采集

        2019年6—8月和2020年5—6月用黑光燈燈誘采集,采樣地點(diǎn)為新田咀保護(hù)站(104.072 19°E,28.683 73°N,海拔1 101 m)、二埝坪觀測(cè)站(104.159 00°E,28.431 00°N,海拔1 536 m)和爛池子(104.036 00°E,28.730 40°N,海拔886 m)。經(jīng)過(guò)展翅、整姿和烘干定型后,標(biāo)本保存于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

        2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

        依據(jù)形態(tài)將2 402號(hào)尺蛾科標(biāo)本初步分為252組,每組選取1~3只,取樣本腿部肌肉組織放置于1.5 mL無(wú)菌EP管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照動(dòng)物通用DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本的總DNA(北京擎科,貨號(hào):TSP201),-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用通用引物擴(kuò)增COⅠ基因LC01490:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,HC02198:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(Folmeretal.,1994)。取PCR產(chǎn)物5 μL,以標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker為參考,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),產(chǎn)物條帶清晰單一,產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期一致送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

        2.3 數(shù)據(jù)分析

        測(cè)序結(jié)果用DNASTAR Lasergene v7.1 Seqman查看峰圖質(zhì)量并進(jìn)行人工校正和拼接,導(dǎo)出為fasta格式。通過(guò)MEGA 7.0分析計(jì)算序列堿基組成,統(tǒng)計(jì)保守位點(diǎn)(C)、變異位點(diǎn)(V)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Pi)和單態(tài)位點(diǎn)(S)等的數(shù)量;結(jié)合BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)屬種的COⅠ基因序列,基于Kimura 2-parameter(K2P)模型,計(jì)算遺傳距離。

        使用BOLD Systems v4數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)Ratnasingham和Hebert(2007)的方法進(jìn)行物種鑒定,認(rèn)為大多數(shù)動(dòng)物的參考閾值是3%,選擇相似度≥97%的匹配結(jié)果,結(jié)合該序列在BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中的形態(tài)記錄(http://www.boldsystems.org/index.php/TaxBrowser_Home),確定種名(Muhammadetal.,2018);若相似度<97%,根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)給出的與查詢(xún)樣本關(guān)系最近的100條序列的分類(lèi)信息,將樣本只確定到科或?qū)俚乃?,避免誤鑒。即若與其關(guān)系最近的100條序列均隸屬于尺蛾科,則該序列也隸屬于尺蛾科,并結(jié)合ID頁(yè)給出的查詢(xún)樣本與其關(guān)系最近的100條序列構(gòu)建的NJ樹(shù)來(lái)判斷。

        采用構(gòu)建NJ樹(shù)和ABGD在線工具(https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)對(duì)只確定到科或?qū)偎降男蛄羞M(jìn)行物種界定(Puillandreetal.,2012;李晶等,2013;楊倩倩等,2018)。用MEGA 7.0基于K2P模型,構(gòu)建NJ樹(shù),檢驗(yàn)支持率的重復(fù)性抽樣次數(shù)為1 000,聚到同一支的序列認(rèn)為是同一個(gè)物種。在ABGD網(wǎng)站提交只鑒定到科、屬水平的序列,最小相對(duì)gap寬度值X設(shè)為1.0,其余參數(shù)為默認(rèn)值,模型選擇K2P,進(jìn)行物種劃分,劃分到同一組的樣本認(rèn)定為同一個(gè)物種(邢樹(shù)文等,2019)。

        3 結(jié)果

        3.1 COⅠ基因堿基組成

        共采集到2 402號(hào)標(biāo)本,獲得了297條鱗翅目尺蛾科COⅠ序列,經(jīng)Clustal W比對(duì)后獲得658 bp等長(zhǎng)片段。利用MEGA 7.0以無(wú)脊椎動(dòng)物密碼子表翻譯成氨基酸序列后,序列中沒(méi)有插入、缺失、刪除或終止密碼子,說(shuō)明所有序列均為功能性線粒體COⅠ基因。297條序列A、T、G、C的平均含量分別為31.0%、39.2%、14.9%、14.8%,A+T含量為70.2%,G+C含量為29.7%,表現(xiàn)出AT偏向性,符合昆蟲(chóng)線粒體基因組A+T含量較高的特點(diǎn)(Simonetal.,2006)。檢測(cè)到保守位點(diǎn)361個(gè),變異位點(diǎn)297個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)271個(gè),單態(tài)位點(diǎn)26個(gè),變異位點(diǎn)的占比為45.1%。

        3.2 物種界定結(jié)果

        通過(guò)BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)297條序列,140條序列鑒定到種,隸屬于74屬95種,60條序列鑒定到屬水平,97條序列只鑒定到科水平。

        以鞘翅目Coleoptera物種Contacyphonpadi(GenBank登錄號(hào):KM286254.1)和歐洲深山鍬甲Lucanuscervus(GenBank登錄號(hào):KM286254.1)為外群,157條只鑒定到科或?qū)俚男蛄袠?gòu)建NJ樹(shù)。結(jié)果顯示,157條序列劃分成96個(gè)單系,聚在一起的支持率均大于99%。ABGD的劃分結(jié)果分為初始劃分和遞進(jìn)劃分。遞進(jìn)劃分在P值為0.001時(shí)劃分成100組,P值為0.001 7、0.002 8和0.004 6時(shí)劃分成99組,P值為0.007 7時(shí)劃分成98組,P值為0.012 9、0.021 5和0.035 9時(shí)劃分成96組;而初始劃分結(jié)果穩(wěn)定,不同的P值均劃分成96組(圖1)。選擇初始劃分結(jié)果作為物種劃分結(jié)果,結(jié)果與NJ樹(shù)的聚類(lèi)結(jié)果一致,呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖2)。通過(guò)構(gòu)建NJ樹(shù)和ABGD在線工具將60條鑒定到屬的序列劃分成35種,隸屬于31屬;97條鑒定到科的序列劃分成61種。

        297條序列隸屬于191種,鑒定到種和屬水平的序列隸屬于92屬(表1)。

        表1 四川老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)尺蛾科昆蟲(chóng)名錄 Table 1 Directory of Geometridae in the Laojunshan National Nature Reserve, Sichuan

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        3.3 遺傳距離分析

        從BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載本文涉及的相關(guān)物種COⅠ序列用于遺傳距離分析,除去序列較短長(zhǎng)度低于500 bp的序列,共有70條序列用于分析兩兩遺傳距離,隸屬于46屬55種。基于K2P模型計(jì)算367條序列的兩兩遺傳距離,發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離最小為0,最大為4.36%,平均種內(nèi)遺傳距離為0.63%,褐緣白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria種內(nèi)遺傳距離最大;種間遺傳距離最小為3.43%,最大為19.12%,黑刺斑黃尺蛾Opisthograptismoelleri和Geometridae sp.18之間為最大種間遺傳距離,平均種間遺傳距離為11.91%,平均種間距離是平均種內(nèi)距離的18.9倍(圖3)。

        4 討論

        在昆蟲(chóng)的實(shí)際研究中,常常會(huì)收集某個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的昆蟲(chóng),其種類(lèi)繁多,隸屬于不同的目、科。大多數(shù)昆蟲(chóng)處在不同的發(fā)育階段,形態(tài)變化較大,親緣關(guān)系較近的昆蟲(chóng)形態(tài)相似;昆蟲(chóng)中普遍存在雌雄二型現(xiàn)象(王孟卿,楊定,2005),這對(duì)于非分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家來(lái)說(shuō)很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定,對(duì)于分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家來(lái)說(shuō)也是巨大的工作量。隨著DNA條形碼技術(shù)的提出,有效解決了這一問(wèn)題,通過(guò)對(duì)特定的基因片段的測(cè)序和比對(duì),較容易確定樣本的分類(lèi)地位。

        本研究采集了2 402號(hào)尺蛾科昆蟲(chóng)標(biāo)本,獲得了297條COⅠ基因序列,隸屬于191種。有95種鑒定到種水平,占總物種數(shù)的49.74%;35種只鑒定到屬水平,占18.32%;61種只鑒定到科水平,占31.93%;未確定到種的物種數(shù)占50.26%。與傳統(tǒng)昆蟲(chóng)的鑒定方法相比,分子鑒定的效率很大程度上取決于基因數(shù)據(jù)庫(kù)的信息量,數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的物種基因信息量越大,DNA條形碼的鑒定效率和準(zhǔn)確性越高。截止到2020年9月,BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)了尺蛾科的124 801條COⅠ基因序列,隸屬于12 110種,約占目前已知尺蛾科物種數(shù)的52.65%,還有許多尺蛾科物種缺少DNA條形碼數(shù)據(jù)。由此可見(jiàn)BOLD DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中尺蛾科部分還有很多信息尚未完善,今后需要大量相關(guān)工作。

        根據(jù)條形碼構(gòu)建NJ樹(shù)來(lái)確定樣品的物種,方法簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀,這一方法在不同的分類(lèi)群中取得了較理想的結(jié)果。Hajibabaei等(2006)鑒定熱帶鱗翅目昆蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn),NJ樹(shù)的鑒定準(zhǔn)確率高達(dá)97.9%。本研究構(gòu)建NJ樹(shù)對(duì)未鑒定到種的序列進(jìn)行聚類(lèi)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),聚在一起的單支支持率均大于99%,表明其劃分結(jié)果可信度高,該結(jié)果與ABGD的劃分結(jié)果一致。能否準(zhǔn)確區(qū)分物種依賴(lài)于所選分子標(biāo)記的物種種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間的分離程度,物種的遺傳距離存在條碼間隙,即物種的最大種內(nèi)遺傳距離小于最小種間遺傳距離(Hebertetal.,2004b)。在本研究中,尺蛾科的平均種間遺傳距離是平均種內(nèi)遺傳距離的18.9倍,符合Hebert等(2004b)提出的10×原則,關(guān)注種內(nèi)遺傳距離較大的物種,比如褐緣白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria,其最大種內(nèi)遺傳距離仍小于最小種間遺傳距離,存在條碼間隙,仍可以將它與其他物種準(zhǔn)確的區(qū)分出來(lái),說(shuō)明以COⅠ基因作為分子標(biāo)記的DNA條形碼技術(shù)可以對(duì)本研究中尺蛾科昆蟲(chóng)進(jìn)行有效分析。

        四川老君山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)鱗翅目尺蛾科昆蟲(chóng)資源豐富,尺蛾科昆蟲(chóng)種類(lèi)的調(diào)查是研究其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和地理親緣關(guān)系的重要資料。本研究只采集了5—8月的鱗翅目尺蛾科樣本,缺少其他月份的鱗翅目尺蛾科的種類(lèi),之后還需要繼續(xù)調(diào)查、補(bǔ)充該地區(qū)鱗翅目尺蛾科昆蟲(chóng)DNA條形碼,構(gòu)建一個(gè)較為完整的保護(hù)區(qū)尺蛾科昆蟲(chóng)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù),為其保護(hù)與利用提供依據(jù)。

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