李雅倩，周逸丹，陳娜，朱蘭*

臨床上許多生殖道疾病包括先天性生殖道畸形、外傷腫瘤等，都會造成陰道正常解剖和功能的異常，嚴重影響患者身心健康。目前利用其他組織進行陰道重建手術是主要治療方法，其中包括自體組織移植，但自體組織陰道重建有體表切口、感染、影響外觀等缺點[1-3]，因此，臨床急需可替代患者自體組織的修復材料。隨著組織工程技術的發(fā)展，通過脫細胞技術得到的同種異體(人尸體來源)及異種(通常是豬小腸黏膜下組織或牛心包)脫細胞基質(zhì)生物補片逐漸引入修復手術[4-5]。同種異體生物補片由于倫理等問題而使其來源受限，異種移植物因種屬來源、組織部分等因素影響其體內(nèi)的降解、并發(fā)癥和治療效果，研究報道其臨床研究效果尚有爭議[6-9]。本研究旨在探討一種豬皮來源的脫細胞基質(zhì)(acellular tissue matrix,ATM)補片在小型豬陰道重建中的作用，通過在小型豬陰道缺損模型中的實驗研究，一方面評價該生物補片在體內(nèi)的降解情況和炎癥反應，另一方面評價其使陰道組織再生的能力，從而為人工陰道成形手術提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物 本研究所用實驗動物為中國小型實驗豬，共6只，雌性，4～6月齡，均性成熟，未孕未產(chǎn)，體重為(25±5)kg。由北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心提供，單圈飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗材料 研究中使用的組織工程生物補片是一種國產(chǎn)脫細胞基質(zhì)材料，來源于豬皮，通過脫細胞處理后去掉細胞成分且天然細胞外基質(zhì)成分及其三維空間構(gòu)象被保留；包裝在無菌生理鹽水中，保存在4℃。

1.1.3 主要試劑 AE1/AE3單克隆抗體，α-actin單克隆抗體，Laminin單克隆抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標二抗，組織固定液，HE染液，VG染色購自中杉金橋生物技術有限公司；其他常用化學試劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小型豬陰道缺損模型的構(gòu)建和補片的植入 小型豬在麻醉狀態(tài)下行陰道切除術以制備陰道缺損模型。之后，陰道外口環(huán)切，向上分離陰道“袖口”；同時將生物補片裁成合適大小，并制成一端閉合，另一端敞開的“套袖”，在補片表面間斷性做6處1 cm長度的縱形切口，以利于引流。將補片塞入陰道腔穴內(nèi)并保證補片和腔穴的粗糙面無間隙地緊貼，最后補片頂端縫合于子宮體段端，下端縫合于陰道前庭黏膜周圍，完成陰道缺損和重建的模型。

1.2.2 HE染色觀察陰道組織大體形態(tài)和炎癥反應的情況 在術后1、2、4、6、8周時分別取材陰道全層并用組織固定液固定，進行石蠟包埋后切片，每片厚度約5 μm，以用于組織形態(tài)學評價。組織切片按照常規(guī)步驟進行脫蠟后分別進行蘇木精和伊紅染色，并于鏡下進行組織形態(tài)的觀察。

1.2.3 VG染色觀察陰道組織膠原纖維和彈力纖維的生成情況 不同時間段的組織切片進行脫蠟后按照VG染色試劑盒的方法染色，組織經(jīng)VG染色后膠原纖維呈現(xiàn)鮮紅色，肌纖維、細胞胞質(zhì)和紅細胞呈現(xiàn)黃色，細胞核呈現(xiàn)黑色。

1.2.4 免疫組化染色評價上皮層和平滑肌的生長情況 不同時間段的組織切片分別進行上皮光譜角蛋白AE1/AE3抗體，層粘連蛋白Laminin抗體和平滑肌肌動蛋白α-actin抗體的免疫組織化學的染色，以表征上皮層，基質(zhì)膜成分和平滑肌肌束的生成。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察及生物補片降解情況

實驗動物手術后未見感染、血腫等并發(fā)癥發(fā)生，不同時間段取材時均未見瘺和排斥等發(fā)生，陰道組織的生長狀態(tài)良好。手術1周后可觀察到陰道空穴內(nèi)有補片的明顯殘留，補片與陰道空穴貼合較緊密，不易分離，陰道黏膜的生長不明顯。2周后，陰道黏膜的生長明顯可見，生物補片不完整。4周后新生黏膜較厚和完整，肉眼觀察其外觀與正常的陰道相似；生物補片不可見。6周后新生陰道的外觀結(jié)構(gòu)接近于正常的陰道黏膜，肉眼不可見未黏膜化的部位。8周后，從外觀觀察其與6周的新生陰道無明顯差異，整個陰道黏膜的形態(tài)完整均一。結(jié)果初步提示該組織工程生物補片可促進陰道黏膜再生。詳見表1。

2.2 陰道重建后上皮生成情況的評價

2.2.1 HE染色觀察新生上皮細胞、新生血管情況及炎癥反應情況 從HE染色結(jié)果可見，該生物補片重建陰道后，1周時沒有明顯看到上皮組織的存在，可觀察到粒細胞和淋巴細胞。2周后陰道上皮層較薄，呈不規(guī)則的排列且疏松，可觀察到淋巴細胞；4周后陰道上皮層較厚，可見多層結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，多見上皮腳釘突，淋巴細胞有減少；6周后陰道上皮層較厚，可見多層結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)上皮極性，多見上皮腳釘突，炎癥細胞較少見；8周時，新生陰道的上皮結(jié)構(gòu)與正常黏膜相似，炎癥細胞較少見。結(jié)果表明，該組織工程生物補片可有效生成陰道上皮層。詳見下頁表1和圖1。

表1 生物補片植入到體內(nèi)后的降解和炎癥反應等情況評價

2.2.2 上皮光譜角蛋白AE1/AE3的免疫組化染色 植入補片2周后AE1/AE3的表達呈現(xiàn)陽性，且隨著陰道重建的時間延長，陽性表達程度也相應增加。結(jié)果與HE染色的觀察一致。結(jié)果表明，在植入生物補片重建陰道后上皮細胞的生成。見圖2。

2.2.3 層粘連蛋白Laminin的免疫組化染色 陰道在手術重建1周后，在表皮層下的基質(zhì)中可以觀察到不連續(xù)棕色條帶，表明Laminin染色結(jié)果陽性，提示陰道內(nèi)形成了基底膜。隨著陰道重建的時間延長，Laminin的陽性表達增強。層粘連蛋白屬非膠原糖蛋白，主要在基底膜結(jié)構(gòu)中，其在陰道重建后的基質(zhì)中表達，間接反映了新生陰道中上皮層的完整性。見圖3(見彩插1)。

2.3 陰道重建后平滑肌和膠原纖維生成情況的評價

2.3.1 平滑肌肌動蛋白α-actin的免疫組化染色 在陰道植入生物補片重建8周后，可觀察到較完整的陰道平滑肌肌束，且肌束排列較整齊。結(jié)果表明該組織工程生物補片的植入可有效生成陰道平滑肌層。見圖4。

2.3.2 VG染色 在陰道重建8周后可觀察到呈現(xiàn)黃色染色的肌纖維以及呈現(xiàn)紅色染色的膠原纖維，且二者的排列較整齊。與平滑肌肌動蛋白α-actin的染色結(jié)果一致。見圖4(見彩插1)。

注：植入2周后，新生陰道的上皮層較薄；4周后新生陰道的上皮呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)，且上皮極向恢復，排列較為松散；6周后新生陰道的上皮呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)且上皮極向恢復，上皮呈現(xiàn)緊密排列；8周后新生陰道的上皮排列情況及結(jié)構(gòu)與正常陰道黏膜類似。

圖1組織工程生物補片重建陰道的不同時間段的HE染色，×200

注：AE1/AE3蛋白的陽性染色在植入補片第2周后出現(xiàn)，且隨著陰道重建的時間延長，陽性表達的程度也相應增加。

3 討論

目前臨床上應用于陰道重建的方式有很多，包括最早應用的刃厚皮片移植以及來源于大陰唇、大腿內(nèi)側(cè)皮片、腹膜、腸管等部位的陰道成形術，但往往有陰道再狹窄，移植物縮短，瘢痕，潤滑不足，鱗狀細胞癌等并發(fā)癥的發(fā)生[10-11]。最常用的乙狀結(jié)腸代陰道成形術的性生活滿意率很好，但由于需要腹部手術而有腸管阻塞、炎癥性腸病、脫垂、二次手術等風險[12-14]。近來，研究較多的自體口腔黏膜陰道成形術有較好的陰道重建效果，但仍需進一步的臨床驗證[11,15]。鑒于現(xiàn)有陰道成形術的不足，臨床上仍需研究開發(fā)新的陰道替代和重建方法。隨著組織工程技術的發(fā)展，其為臨床上的各種陰道缺失缺陷提供了新的治療方法。有研究報道活檢取得的陰道細胞經(jīng)體外培養(yǎng)數(shù)周后形成上皮組織并置于陰道模具上，患者攜帶模具4～6周后可見陰道組織的形成，然而該方法仍需進一步研究和臨床驗證[16]。近年來，ATM材料在骨骼肌重塑、心肌梗塞的血管再生等的研究尤其是在皮膚損傷的臨床應用，給陰道重建帶來啟示[17-20]。目前臨床上應用的ATM材料有同種異體(人新鮮尸體)和異種(豬小腸和牛心包等)來源[21]，二者在陰道重建的作用是否有差異，目前尚不明了。既往研究表明人尸皮來源的脫細胞生物補片在小型豬陰道重建中療效可行[21]。本研究對豬皮來源的脫細胞生物補片在小型豬陰道缺損模型中的陰道組織再生的性能進行了初步評價，結(jié)果提示同源組織工程生物補片進行陰道重建時可形成完整的陰道黏膜和平滑肌，與正常陰道結(jié)構(gòu)相似，為后續(xù)臨床研究提供了實驗依據(jù)。

本研究使用的小型豬模型的陰道黏膜由上皮、固有層和肌層等構(gòu)成，這與人陰道黏膜極為類似[22]，因此本研究選用小型豬作為實驗動物具備可比性。此外，本研究采用的組織工程生物補片來源于豬皮。已有研究表明，除角質(zhì)層外，豬在表皮的組織學結(jié)構(gòu)、角蛋白的特征、膠原纖維的纖維束和真皮厚度等方面，與人均相似。本研究結(jié)果表明，陰道在植入補片后無明顯粘連、狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生。植入生物補片2周后，大體觀察可見上皮層的出現(xiàn)，提示該組織工程生物補片的上皮化時間較短。人工陰道重建的一個重要評價指標是能否快速誘導上皮化，本研究進一步從組織形態(tài)學染色和上皮角蛋白AE1/AE3的染色證明，植入生物補片2周后上皮細胞標志物呈陽性表達，且隨著重建時間的延長，陽性表達增強，4周后上皮層的極性恢復，8周時上皮層呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)，與正常陰道黏膜相似。此外，基底膜成分可使上皮細胞的附著、遷移和分化能力增強，從而有利于補片的上皮化[18,23-25]。本研究結(jié)果顯示，基質(zhì)膜重要成分層粘連蛋白Laminin在補片植入2周后即呈陽性表達，隨著時間的延長，陽性表達趨于均一，提示陰道重建后基底膜成分的生成，一定程度上證明了新生陰道上皮的完整性。與以往研究的人尸皮來源的生物補片相比[26]，該組織工程生物補片在陰道黏膜上皮化的速度和上皮層的形態(tài)結(jié)構(gòu)再生方面達到相似結(jié)果。

正常陰道由表面的復層鱗狀上皮，內(nèi)環(huán)外縱排列的平滑肌層和外膜構(gòu)成。研究表明，平滑肌和成纖維細胞在維持陰道結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。而結(jié)締組織中大量存在的細胞外基質(zhì)成分尤其是膠原纖維和彈力纖維等與陰道支持作用和組織彈性相關[27-28]。因此，利用生物補片再生的完整新生陰道組織應有平滑肌束和細胞外基質(zhì)成分。為了評價再生陰道的組織結(jié)構(gòu)完整性，本研究通過評價平滑肌肌動蛋白α-actin的表達表明，植入生物補片4周后可見散在的肌纖維，8周后可見較為連續(xù)的平滑?。煌瑫r8周后膠原纖維的排列較為緊密和整齊，該組織工程生物補片在平滑肌再生方面的性能較好，與以往研究的人尸皮來源的ATM材料達到類似結(jié)果。

在臨床應用時生物補片的免疫源性也是評價指標之一，以往研究報道ATM材料由于去掉細胞成分而大大降低了免疫源性，在本研究的實驗過程中無明顯免疫排斥反應發(fā)生，植入生物補片1周后可觀察到炎癥細胞，但4周后炎癥細胞明顯減少；表明該組織工程生物補片無明顯的免疫排斥。但本研究采用的動物模型與生物補片的來源屬同種，因此在研究補片免疫源性問題上有一定局限性，后續(xù)可在其他動物模型上驗證并延長觀察時間。

本研究構(gòu)建小型豬陰道缺損和重建模型，從實驗動物的圍手術期和手術后的不同時間點進行結(jié)果觀察以及新生陰道的大體和組織形態(tài)學評價，闡述了生物補片上皮化的時間過程，首次證明豬皮來源的組織工程生物補片在豬陰道重建術后8周即有效快速再生陰道上皮層和平滑肌層，新生陰道結(jié)構(gòu)完整，可作為陰道重建的材料，為同源組織工程生物補片在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。此外，本研究采用的是小型豬作為研究對象，其與臨床仍有一定差距，后續(xù)工作將進一步擴大樣本量和在更接近人體的動物身上驗證其有效性和安全性，進而到人體進行臨床實驗研究。本研究不足之處在于實驗動物例數(shù)偏少和缺少定量結(jié)果的評價，后續(xù)研究中需增加功能評價。