邵 林，李同相，肖 睿，王冰玲，鄧焰軍

（宜賓市第一人民醫(yī)院a:骨二科；b:整形燒傷科，四川宜賓644000）

骨肉瘤屬于骨原發(fā)性惡性腫瘤，其主要特點為侵襲性強(qiáng)、致死率高、致殘率高及預(yù)見性差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。目前放射治療是治療骨肉瘤的主要手段，但放射抵抗明顯降低其治療效果［2］。因此增強(qiáng)骨肉瘤患者放射敏感性成為亟待解決的問題。長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1（long non-coding RNA taurine upregulated gene1,LncRNA TUG1）在骨肉瘤中的表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后不良及病情有關(guān)［3］。長鏈非編碼的RNA TUG1通過在骨肉瘤細(xì)胞中充當(dāng)mir-335-5p的ceRNA而促進(jìn)遷移和侵襲［4～6］。然而，TUG1對骨肉瘤放射敏感性的影響仍然未知。因此本研究主要探討放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中TUG1變化對骨肉瘤細(xì)胞凋亡及放射敏感性的影響，分析其是否可通過吸附miR-328-3p而發(fā)揮作用以期為骨肉瘤治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人成骨細(xì)胞hFOB 1.19由上海通派生物科技有限公司提供，骨肉瘤細(xì)胞HOS由上海賽默生物科技發(fā)展有限公司提供。

RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen公司；si-TUG1、miR-328-3p mimic、miR-328-3p inhibitor及其陰性對照質(zhì)粒均購自上海吉瑪生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR G人PCR Master Mix試劑盒均購自美國ABI公司。

1.2 細(xì)胞處理

室溫使用X射線放療機(jī)（6 MeV X）射線垂直照射細(xì)胞，照射劑量率為2.0 Gy/min，調(diào)整靶皮距（70 cm），照射劑量為600 cGy/次，培養(yǎng)12 h，用0.25%胰蛋白酶消化存活細(xì)胞，消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以上過程重復(fù)5次后將其命名為HOS-R細(xì)胞。

HOS-R細(xì)胞生長融合度達(dá)50%～80%時參照Li?pofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將si-TUG1、miR-328-3p mimic及其相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染入HOS-R細(xì)胞，分別命名為沉默對照組、沉默TUG1組、過表達(dá)miR-NC組、過表達(dá)miR-328-3p組。再進(jìn)行si-TUG1與miR-NC共轉(zhuǎn)染，命名為TUG1+抑制miRNC組；si-TUG1與miR-328-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染，命名為沉默TUG1+抑制miR-328-3p組。轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后棄轉(zhuǎn)染液并將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)［7］。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 照射與克隆形成試驗

收取生長良好的HOS細(xì)胞與HOS-R細(xì)胞接種于6孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細(xì)胞，若出現(xiàn)細(xì)胞克隆團(tuán)終止培養(yǎng)，用PBS洗滌3次×10 min，采用甲醇固定，20 min后用吉姆薩染色，40 min后用清水洗滌，置于顯微鏡下觀察有效克隆數(shù)。繪制放射存活曲線圖。

1.3.2 qRT-PCR檢測

收集hFOB 1.19、HOS、HOS-R細(xì)胞及轉(zhuǎn)染各組HOS-R細(xì)胞，分別加入Trizol試劑提取RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，qRT-PCR法檢測TUG1、miR-328-3p相對表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測

HOS-R細(xì)胞經(jīng)4Gy劑量照射48 h后用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入100 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度（2×105個細(xì)胞/ml），取 195 μl細(xì)胞懸液依次加入 5 μl Annexin V-FITC（避光孵育 15 min，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min）與5 μl PI（避光孵育15 min），放入流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.4 基因雙熒光素酶檢測

將含有miR-328-3p結(jié)合位點的TUG1 3'UTR序列及其突變體插入熒光素酶報告基因載體中得到TUG1-Wt、TUG1-Mut，同時將HOS-R細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)80%左右時分別將miR-328-3p mimic或 miR-NC與 TUG1-Wt、TUG1-Mut共轉(zhuǎn)染HOS-R細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書測定相對熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中TUG1高表達(dá)

細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與TUG1表達(dá)檢測結(jié)果見圖1。放射后HOS-R骨肉瘤細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著高于HOS細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Gy為2時（P<0.001），Gy為 4時（P<0.001），Gy為 6時（P<0.001），Gy為8時（P<0.001）；HOS與HOS-R細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平均顯著高于人成骨細(xì)胞hFOB 1.19（P<0.001），HOS-R細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平顯著高于HOS細(xì)胞（P<0.001）。

圖1 放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中TUG1的表達(dá) 1a:骨肉瘤細(xì)胞和放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞的放射存活曲線圖 1b:人成骨細(xì)胞hFOB 1.19和骨肉瘤細(xì)胞、放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中TUG1的表達(dá)情況，與骨肉瘤細(xì)胞相比，aP<0.05；與hFOB 1.19細(xì)胞相比，bP<0.05

2.2 沉默TUG1增加HOS-R細(xì)胞的放射敏感性

沉默對照組TUG1的表達(dá)量為（1.01±0.07），沉默TUG1組TUG1的表達(dá)量為（0.27±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。不同劑量照射向兩組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)見圖2，沉默TUG1組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較沉默對照組顯著減少（P<0.05），Gy為2時（P<0.001），Gy為4時（P=0.000），Gy為6時（P<0.001），Gy為8時（P<0.001）。沉默TUG1組HOS-R細(xì)胞增敏比（SER）為 1.539。

圖2 沉默TUG1對放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞放射敏感性的影響

2.3 沉默TUG1促進(jìn)放射照射誘導(dǎo)的HOS-R細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見圖3。沉默TUG1組與沉默對照+4Gy組較沉默對照組放射照射誘導(dǎo)的HOS-R細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.001），與沉默對照+4Gy組相比，沉默TUG1+4Gy組明顯增加HOS-R細(xì)胞凋亡率（P<0.001）。

圖3 沉默TUG1對4Gy輻射照射48 h后HOS-R細(xì)胞凋亡的影響 3a:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 3b:細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果直方圖，與沉默對照組相比，aP<0.05；與沉默對照+4Gy組相比，bP<0.05

2.4 TUG1可吸附調(diào)節(jié)miR-328-3p的表達(dá)

miR-328-3p基因雙熒光素酶檢測結(jié)果見圖4。過表達(dá)miR-328-3p組相對熒光素酶活性顯著降低（P=0.00），突變型TUG1-Mut相對熒光素酶活性無明顯變化（P=0.367）。qRT-PCR檢測沉默 TUG1后HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p相對表達(dá)量明顯高于沉默對照組（P<0.001）。

圖4 TUG1可調(diào)控miR-328-3p的表達(dá) 4a:TUG1與miR-328-3p互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點示意圖 4b:過表達(dá)miR-328-3p對熒光素酶活性的影響 4c:沉默TUG1對HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p表達(dá)的影響

2.5 過表達(dá)miR-328-3p增加HOS-R細(xì)胞的放射敏感性

miR-328-3p的表達(dá)對HOS-R細(xì)胞的放射敏感性的影響見圖5。HOS細(xì)胞與HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p的表達(dá)水平較hFOB 1.19細(xì)胞降低（P<0.001）；miR-328-3p mimic轉(zhuǎn)染HOS-R細(xì)胞后其表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）；過表達(dá)miR-328-3p+4Gy組細(xì)胞凋亡率顯著高于過表達(dá)miR-NC+4Gy組（P<0.001）。過表達(dá) miR-328-3p放射增敏比為1.493。

圖5 過表達(dá)miR-328-3p對HOS-R細(xì)胞放射敏感性的影響：結(jié)果示與hFOB 1.19、HOS細(xì)胞相比，aP<0.05；與HOS細(xì)胞相比，bP<0.05；與過表達(dá)miR-NC組相比，cP<0.05；與過表達(dá)miR-NC+4Gy組相比，dP<0.05 5a:人成骨細(xì)胞hFOB 1.19和HOS、HOS-R骨肉瘤細(xì)胞中miR-328-3p的表達(dá) 5b:過表達(dá)miR-328-3p后HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p的表達(dá)情況5c:過表達(dá)miR-328-3p對HOS-R細(xì)胞放射敏感性的影響情況 5d:過表達(dá)miR-328-3p對放射誘導(dǎo)的HOS-R細(xì)胞凋亡的影響

2.6 抑制miR-328-3p逆轉(zhuǎn)了沉默TUG1對HOS-R細(xì)胞放射敏感性的影響

抑制miR-328-3p對沉默TUG1對HOS-R細(xì)胞放射敏感性的影響見圖6。抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p表達(dá)水平顯著降低（P<0.001）；抑制 miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著較高，抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后放射誘導(dǎo)的HOS-R細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.001）。與沉默TUG1組放射增敏比（SER=1.487）相比，抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細(xì)胞放射增敏比（SER=0.726）明顯降低。

圖6 抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對HOS-R細(xì)胞放射敏感性及放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響：結(jié)果示與沉默對照組相比，aP<0.05；與沉默TUG1+抑制miR-NC組相比，bP<0.05 6a:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1后HOS-R細(xì)胞中miR-328-3p的表達(dá) 6b:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對HOS-R細(xì)胞放射敏感性的影響 6c:抑制miR-328-3p聯(lián)合沉默TUG1對放射誘導(dǎo)的HOS-R細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

TUG1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默TUG1表達(dá)后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。沉默TUG1表達(dá)還可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力［9］。宮頸癌細(xì)胞中TUG1表達(dá)上調(diào)，抑制TUG1表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲能力亦受到抑制并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。TUG1在肺癌組織中表達(dá)水平高于對應(yīng)癌旁組織，其表達(dá)量與腫瘤直徑增大、高TNM分期相關(guān)，抑制其表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，沉默TUG1則可促進(jìn)P16 m RNA及蛋白表達(dá)水平從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長［11］。與人正常乳腺上皮細(xì)胞HGC-27相比，TUG1在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，下調(diào)其表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，TUG1還可通過競爭性結(jié)合miR-145而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的進(jìn)展［12］。與鄰近組織中TUG1的表達(dá)相比，前列腺癌組織中TUG1的表達(dá)水平顯著升高，其表達(dá)量與患者生存期有關(guān)，下調(diào)其表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，敲除TUG1可抑制DGCR8的表達(dá)，上調(diào)TUG1表達(dá)后可促進(jìn)DGCR8的表達(dá)，即TUG1可通過上調(diào)DGCR8的表達(dá)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲［13］。本研究結(jié)果顯示，HOS與HOS-R細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平顯著升高，且同時隨著照射劑量的不斷增加HOS細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于HOS-R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，說明放射后可降低HOS細(xì)胞存活率但對HOS-R細(xì)胞無明顯影響，其可能通過上調(diào)TUG1表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)HOS-R細(xì)胞放射抵抗。經(jīng)照射后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯下降，細(xì)胞凋亡率隨著沉默TUG1表達(dá)而顯著增加，說明沉默TUG1表達(dá)可顯著增強(qiáng)HOS-R細(xì)胞放射敏感性。提示抑制TUG1基因表達(dá)可能成為增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞放射敏感性的潛在治療靶點。

本研究用靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測TUG1與miR-328-3p存在結(jié)合位點，推測TUG1可能對miR-328-3p有一定調(diào)控作用。提示TUG1可能通過靶向調(diào)控miR-328-3p的表達(dá)從而降低骨肉瘤細(xì)胞放射敏感性。miR-328-3p在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-328-3p表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力并可增強(qiáng)其放射敏感性［14］。miR-328-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平均明顯降低，并在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-328-3p可結(jié)合TUG1的3’UTR序列。沉默TUG1基因后miR-328-3p表達(dá)水平明顯升高，上調(diào)miR-328-3p表達(dá)顯著抑制HOS-R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而增強(qiáng)HOS-R細(xì)胞的放射敏感性。抑制miR-328-3p表達(dá)聯(lián)合沉默TUG1表達(dá)后HOS-R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯增加而細(xì)胞凋亡率明顯降低，放射增敏比亦明顯降低，提示TUG1可直接調(diào)控miR-328-3p表達(dá)而影響HOS-R細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，TUG1在骨肉瘤細(xì)胞與放射抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)，而miR-328-3p的表達(dá)量下調(diào)，TUG1可通過靶向作用于miR-328-3p從而調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞放射敏感性，沉默TUG1表達(dá)可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的放射敏感性。但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。