陶建萍，蔡永林

（梧州市紅十字會醫(yī)院醫(yī)學檢驗科一區(qū)，廣西 梧州 543002）

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是一種革蘭陽性菌，直徑約為1 μm，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列。肺炎鏈球菌感染主要引起人類大葉性肺炎。該病原菌屬于苛養(yǎng)型細菌，對其進行培養(yǎng)的條件相對較高[1]。目前，臨床上主要是采用細菌培養(yǎng)法及聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等對肺炎鏈球菌進行病原學檢測，但通常只能檢測一類抗原，對于混合感染或其他抗原則無法檢出。因此，尋找一種高效、敏感、特異、快速的肺炎鏈球菌病原學檢測技術(shù)至關(guān)重要[2-3]。本文主要是探討呼吸道病原菌基因檢測法在診斷兒童肺炎鏈球菌感染中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018 年2 月至2019 年2 月期間收治的300例初步診斷為細菌性肺炎的患兒作為研究對象。其納入標準是[4]：存在高熱、寒戰(zhàn)、咳嗽、咳痰等癥狀；白細胞計數(shù)和血清C 反應(yīng)蛋白的水平升高；病歷資料完整；其家長知悉本研究內(nèi)容，并簽署了自愿參與本研究的知情同意書。其排除標準是：合并有呼吸道感染以外的其他感染；病歷資料缺失；中途轉(zhuǎn)院或退出本研究。在這些患兒中，有男165 例，女135 例；其年齡為5 個月～13 歲，平均年齡為（4.11±1.43）歲；其病程為2 ～9 d，平均病程為（5.35±1.79）d；其中，采集支氣管肺泡灌洗液作為檢測標本的患兒有91 例，采集深部痰作為檢測標本的患兒有209例。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集、處理 深部痰標本：為患兒采集深部痰標本的時間為入院后接受抗菌治療前，并由專業(yè)護士進行采集。在采集標本當天的清晨，為患兒清潔口腔，采用吸痰器獲取其2 份呼吸道深部痰液，置于無菌試管中保存待檢。每低倍鏡視野內(nèi)的白細胞數(shù)超過25 個且上皮細胞數(shù)小于10 個為達到深部痰的采集要求。支氣管肺泡灌洗液：將Olumpus/Fujinon 纖維支氣管鏡經(jīng)患兒的鼻腔插入支氣管內(nèi)，到達感染肺段后經(jīng)配套的洗滌管鏡快速注入溫生理鹽水10 ～20 mL，對灌洗液進行負壓吸引，將吸引出的灌洗液收集在無菌瓶內(nèi)備檢，灌洗液應(yīng)收集超過5 mL。收集后的深部痰標本和支氣管肺泡灌洗液需在30 min 內(nèi)送測。

1.2.2 傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng) 將支氣管肺泡灌洗液或深部痰標本接種于哥倫比亞平板上（平板內(nèi)含有5% 的綿羊血），將平板放入含二氧化碳（濃度5% ～10%）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ～48 h。對標本進行染色鏡檢，分離病原菌，并采用膽汁溶菌試驗和Optochin 試驗鑒定分離出的病原菌是否為肺炎鏈球菌。

1.2.3 呼吸道病原菌基因檢測 1）試劑與儀器。呼吸道病原菌核酸提取試劑、細菌基因組DNA 提取試劑盒Ⅱ、20μL的恒溫擴增試劑（作為反應(yīng)液）、RtisochipTM–A 恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀及配套的軟件。2）檢測方法。采用呼吸道病原菌核酸提取試劑及恒溫擴增芯片法提取支氣管肺泡灌洗液或深部痰標本中的核酸，立即對核酸進行基因檢測。檢測完成后，采用最大二階倒數(shù)法計算出“S”型擴增曲線進入快速擴增期的第一個拐點，“S”型曲線的首個拐點與原點對應(yīng)時刻的差值≤30，表示檢測結(jié)果呈陽性。核酸檢測試劑盒能夠檢測出銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、耐甲氧西林葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動桿菌8 種常見的呼吸道病原菌。

1.3 觀察指標

比較對這300 例患兒進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)及呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果。比較進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)及呼吸道病原菌基因檢測的用時。觀察并記錄對這300 例患兒的不同標本（支氣管肺泡灌洗液標本和深部痰標本）進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果及用呼吸道病原菌基因檢測法診斷其肺炎鏈球菌感染的效能。統(tǒng)計進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)及呼吸道病原菌基因檢測診斷兒童肺炎鏈球菌感染的一致性。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用%表示，用χ2 檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，用Mann-Whitney U 檢驗；采用Kappa 進行一致性檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)及呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果

對本研究中300 例患兒進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果顯示，其中肺炎鏈球菌呈陽性的患兒有165 例，呈陰性的患兒有135 例，其肺炎鏈球菌的陽性檢出率為55.00%。對這300 例患兒進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)的結(jié)果顯示，其中肺炎鏈球菌呈陽性的患兒有118 例，呈陰性的患兒有182 例，其肺炎鏈球菌的陽性檢出率為39.33%。與對這300 例患兒進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)相比，對其進行呼吸道病原菌基因檢測其肺炎鏈球菌的陽性檢出率更高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)及呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果

2.2 進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)與呼吸道病原菌基因檢測的用時

對本研究中300 例患兒進行傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)的平均用時為（46.31±6.17）h，對其進行呼吸道病原菌基因檢測的平均用時為（1.95±0.29）h，二者相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 對不同標本進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果

對本研究中300 例患兒的91 份支氣管肺泡灌洗液標本進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果顯示，其中檢測結(jié)果呈陽性的標本有49 份（其中有11 份標本為進行傳統(tǒng)病原學培養(yǎng)結(jié)果呈陰性的標本）。對這300 例患兒的209 份深部痰標本進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果顯示，其中檢測結(jié)果呈陽性的標本有116 份（其中有45 份標本為進行傳統(tǒng)病原學培養(yǎng)結(jié)果呈陰性的標本）。詳見表2。

表2 對不同標本進行呼吸道病原菌基因檢測的結(jié)果（份）

2.4 用呼吸道病原菌基因檢測法診斷患兒肺炎鏈球菌感染的效能

用呼吸道病原菌基因檢測法診斷本研究中300 例患兒肺炎鏈球菌感染的特異度、靈敏度、總符合率、陰性預測值、陽性預測值分別為69.40%、92.37%、83.20%、93.38%、78.67%。當檢測標本為支氣管肺泡灌洗液時，用呼吸道病原菌基因檢測法診斷這300 例患兒肺炎鏈球菌感染的特異度、靈敏度、總符合率、陰性預測值、陽性預測值分別為78.85%、95.00%、85.87%、95.35%、81.20%。當檢測標本為深部痰時，用呼吸道病原菌基因檢測法診斷這300 例患兒肺炎鏈球菌感染的特異度、靈敏度、總符合率、陰性預測值、陽性預測值分別為66.15%、91.03%、75.12%、92.47%、77.55%。詳見表3。

2.5 進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)與呼吸道病原菌基因檢測診斷兒童肺炎鏈球菌感染的一致性

本研究中，進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)與呼吸道病原菌基因檢測診斷兒童肺炎鏈球菌感染的一致性較好（Kappa=0.625，P＜0.001）。詳見表4。

表4 進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)與呼吸道病原菌基因檢測診斷兒童肺炎鏈球菌感染的一致性（例）

3 討論

兒童是社區(qū)獲得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）的高發(fā)群體。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CAP 是導致5歲以下兒童死亡的主要原因，全世界每年有超過200 萬嬰幼兒死于CAP[5-6]。引起CAP 的病原體主要為細菌，其次為支原體、病毒、衣原體等。對細菌性肺炎患兒進行抗菌治療前需明確其感染的病原菌種類，以便為其用抗菌活性強的抗生素，快速緩解其病情[7-8]。肺炎鏈球菌是引起小兒肺炎的主要病原菌之一。肺炎鏈球菌的病原學診斷較為困難，主要體現(xiàn)下在以下三個方面：1）進行病原菌培養(yǎng)時，需要通過侵入性操作采集患兒的支氣管肺泡灌洗液、深部痰等標本進行檢測，而獲得患兒家長的同意較為困難。2）肺炎鏈球菌可產(chǎn)生自溶酶，因此對送檢時間的要求較為嚴格。3）抗菌藥物的廣泛使用可對肺炎鏈球菌的培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生影響[9-11]。近年來，隨著分子生物學的興起，臨床上出現(xiàn)了新的病原學檢測方法（即通過基因工程技術(shù)及生物學技術(shù)建立多種病原菌基因檢測模型，用以檢測各類病原菌），此方法具有靈敏、快速及全面等優(yōu)點[12-13]。本研究中對患兒進行呼吸道病原菌基因檢測使用的方法是恒溫擴增芯片法。該方法在耶爾森菌、空腸彎曲菌、嗜肺軍團菌等病原菌的病原學檢測中也多有報道[14]。本研究的結(jié)果顯示，用呼吸道病原菌基因檢測法診斷本研究中300 例患兒肺炎鏈球菌感染的特異度、靈敏度、總符合率、陰性預測值、陽性預測值分別為69.40%、92.37%、83.20%、93.38%、78.67%；進行傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)與呼吸道病原菌基因檢測診斷兒童肺炎鏈球菌感染的一致性較好。這與錢婧等[15]的報道基本一致。另外，對支氣管肺泡灌洗液、深部痰等標本進行病原菌培養(yǎng)的時間較長，而對這些標本進行呼吸道病原菌基因檢測的用時較短，在2 h 左右即可完成檢測，具有操作簡便、檢測耗時短等優(yōu)點。

綜上所述，用呼吸道病原菌基因檢測法診斷兒童肺炎鏈球菌感染的靈敏度、總符合率、陰性預測值等較高，與進行傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)的結(jié)果一致性較好，且檢測用時較短。