郭恒臣，孫永剛，劉國良

（1.海倫市人民醫(yī)院耳鼻喉科，黑龍江 海倫 152300；2. 海倫市中醫(yī)院麻醉科，黑龍江 海倫 152300）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種獨特的、由鼻咽黏膜病變引起的頭頸部鱗狀細胞癌，多發(fā)生于咽隱窩。鼻咽癌與頭頸部腫瘤具有相似的細胞或組織譜系，但其發(fā)生機制與頭頸部腫瘤不同。鼻咽癌相對不常見。2018 年，全球約有129000 例鼻咽癌新發(fā)病例，占新發(fā)確診癌癥病例總數(shù)的0 ～7%[1]。鼻咽癌具有獨特的發(fā)病地理格局。超過70%的鼻咽癌新發(fā)病例發(fā)生在東亞和東南亞。在中國，鼻咽癌的年齡標準化發(fā)病率為30/10 萬[2]。而在美國和歐洲，鼻咽癌的年齡標準化發(fā)病率不到1/10 萬[1,3]。男性鼻咽癌的發(fā)病率高于女性。鼻咽癌的發(fā)生與愛潑斯坦- 巴爾病毒（EBV）感染、遺傳易感性和環(huán)境因素等多種危險因素相關(guān)[4-7]。與未分化癌相關(guān)鼻咽癌的發(fā)展需要EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的參與。鼻咽癌的發(fā)生機制一直沒有得到很好的闡述。近年來，國際科研機構(gòu)對腫瘤疾病進行大規(guī)?；虮磉_譜研究[8]，獲得了一定數(shù)量的腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。整合生物信息學(xué)方法與表達譜分析技術(shù)分析處理這些臨床研究數(shù)據(jù)，可以更好地探討鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)機制，為鼻咽癌的醫(yī)學(xué)研究提供有價值的線索。

1 資料與方法

1.1 鼻咽癌基因表達數(shù)據(jù)集

從Home-GEO-NCBI 網(wǎng) 站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 下 載 鼻 咽 癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）組織Expression profiling 表達數(shù)據(jù)。實驗樣品由121 例樣本組成（GSE12452、GPL570 實驗平臺的41 例樣本，于2019 年3 月25 日 公 開；GSE13597、GPL96 實 驗平臺的28 例樣本，于2018 年8 月10 日公開；GSE53819、GPL6480 實驗平臺的36 例樣本，于2019 年8 月1 日公開；GSE64634、GPL570 實驗平臺的16 例樣本，于2019 年3月25 日公開；合計86 例腫瘤樣本，35 例對照樣本）。

1.2 整合高通量功能基因表達原始數(shù)據(jù)進行分析

用Bioconductor 軟件包及GEO2R/GEO query 處理四個芯片數(shù)據(jù)。用經(jīng)典t檢驗確定差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），以統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P＜0.05）和[logFC]|> 1 作為篩選標準定義DEGs[9]。

1.3 基因和信號途徑富集分析

綜合應(yīng)用多個數(shù)據(jù)庫分析候選DEGs，進行DAVID 基因注釋，同時使用Kegg pathway（http：//www.genome.jp/kegg）、Reactome（http：//www.reactome.org）、Panther（http://www.pantherdb.org/）進行基因（GO）分析和信號通路途徑富集分析[8]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）、模塊分析和重要候選基因的整合及途徑鑒定

應(yīng) 用 數(shù) 據(jù) 庫STRING（http ：//string-db.org）、 制 圖Cytoscape 軟件繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）[10]，分析鼻咽癌分析結(jié)果DEGs 的作用圖譜。同時，使用蛋白作用分析器插件計算節(jié)點蛋白值。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌中DEGs 的鑒定

在NCBI-GEO 免費的微陣列/ 基因譜數(shù)據(jù)庫查詢鼻咽 癌 組 織 芯 片（GSE12452、GSE13597、GSE53819 和GSE64634）及對照樣本檢測數(shù)據(jù)。分別從對應(yīng)表達譜數(shù)據(jù)集中提取1374 個、1524 個、1471 個、3367 個DEGs。與對照正常組織樣本相比，從四組芯片中共鑒定114 個共表達DEGs（見圖1），其中包括38 個上調(diào)基因和76 個下調(diào)基因（見表1）。

圖1 鑒別GSE12452、GSE13597、GSE53819 和GSE64634 中114 個DEGs

表1 同正常對照鼻咽癌組織相比，從四個數(shù)據(jù)集鑒定出114 個DEGs

2.2 鼻咽癌DEGs 的GO 分析

使用多個數(shù)據(jù)庫聯(lián)合進行DEGs 的GO 分析，將DEGs分為三個功能組：分子功能組、生物過程組和細胞成分組（見圖2 A）。在生物過程組中，上調(diào)表達基因主要集中在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的負調(diào)控、細胞對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、細胞胞吐過程中，而下調(diào)表達基因主要與蛋白酶體蛋白分解代謝過程的正調(diào)控、蛋白酶體泛素依賴蛋白分解過程的調(diào)控密切相關(guān)；在分子功能組中，上調(diào)表達基因主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合的過程中，而下調(diào)基因同樣與蛋白質(zhì)結(jié)合、非共價相互作用相關(guān)；在細胞成分組中，上調(diào)基因主要富集在細胞部分，而下調(diào)的基因主要富集在細胞質(zhì)、細胞膜、細胞外細胞器。多數(shù)DEGs 與蛋白質(zhì)結(jié)合及代謝、細胞骨架蛋白、酶活性反應(yīng)顯著相關(guān)。詳見圖2 B 和表2。

圖2 鼻咽癌中DEGs 的基因本體分析（A）經(jīng)GO 分析將DEGs 分為3 組（即分子功能組、生物學(xué)過程組和細胞成分組）；（B）經(jīng)GO 分析居前30 位的DEGs

表2 上調(diào)及下調(diào)DEGs 的GO 分析

2.3 DEGs 的信號通路富集分析

使 用KEGG PATHWAY、Reactome、Panther 和Gene Ontology 在線數(shù)據(jù)庫進行DEGs 功能和信號通路富集分析。DEGs 主要富集于癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細胞粘附分子（CAMs）、代謝途徑及PI3K-Akt 信號傳導(dǎo)途徑（見圖3、表3）。

圖3 NPC 中DEGs 功能和信號通路富集

表3 NPC 中DEGs 信號通路富集分析

2.4 DEGs 的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

用鑒定出的114 個DEGs（36 個上調(diào)基因和78 個下調(diào)基因）繪制蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含114 個節(jié)點和453 作用連線。在114 個節(jié)點中，36 個中心節(jié)點基因被識別，過濾標準設(shè)定為：相互作用關(guān)系大于10 標準為中心節(jié)點，即每個節(jié)點具有10 個以上的連接或相互作用。36 個節(jié)點基因 是FN1、CD19、C3、CXCL10、CLU、PROM1、CD22、MMP3、CR2、SCGB1A1、MEF2C、PAX5、PIGR、GAD1、PLAU、MAD2L1、MSLN、VCAN、DST、HOXA10、LTF、MS4A1、MUC16、PTGDS、ANG、SPAG6、TCL1A、TEKT2、TSPAN8、ATP12A、BANK1、CR1、DNAI1、KLF2、KRT7 和NRXN1。同時，從PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選構(gòu)建2 個亞信號通路網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE 進行進一步分析。通路富集分析亞網(wǎng)絡(luò)A 由19 個節(jié)點和50 個相互作用關(guān)系組成（見圖4A），主要與癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、TNF 信號通路、NF-κB信號通路、Toll 樣受體信號通路有關(guān)；亞網(wǎng)絡(luò)B 由19 個節(jié)點和45 個相互作用關(guān)系組成（見圖 4B），其主要與細胞粘附分子（CAMs）、PI3K-Akt 信號通路、氨基酸代謝信號通路相關(guān)。

圖4. DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析（在Orange 中36 個上調(diào)基因呈紅色，78 個下調(diào)基因呈藍色）；（A）亞網(wǎng)絡(luò)A 由19 個節(jié)點和50 個相互作用關(guān)系組成；（B）亞網(wǎng)絡(luò)B 由19 個節(jié)點和45 個相互作用關(guān)系組成

3 討論

近年來，鼻咽癌的診斷和治療都取得了長足的進步。血漿EBV DNA 已被證明是鼻咽癌篩查、診斷、監(jiān)測和治療中重要的生物標志物?；谏锎髷?shù)據(jù)分析、篩選及確定相關(guān)信號通路的研究已經(jīng)逐步在科研領(lǐng)域開展。本次研究中利用NCBI-GEO 數(shù)據(jù)平臺，提取4 個基因芯片數(shù)據(jù)集，篩選DEGs 并富集分析DEGs 功能，發(fā)現(xiàn)36 個節(jié)點基因（FN1、CD19、C3、CXCL10、CLU、PROM1、CD22、MMP3、CR2、SCGB1A1、MEF2C、PAX5、PIGR、GAD1、PLAU、MAD2L1、MSLN、VCAN、DST、HOXA10、LTF、MS4A1、MUC16、PTGDS、ANG、SPAG6、TC L1A、TEKT2、TSPAN8、ATP12A、BANK1、CR1、DNAI1、KLF2、KRT7、NRXN1），這些節(jié)點基因均與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

前簇蛋白（clusterin，CLU）是一種廣泛分布在細胞之間的蛋白質(zhì)，可參與許多生物學(xué)過程，例如組織分化、細胞粘附、細胞間或細胞與基質(zhì)之間的相互作用等。最近人們發(fā)現(xiàn)，CLU 涉及許多病理狀態(tài)（如神經(jīng)變性和癌癥）的發(fā)生發(fā)展。CLU 在多種癌癥組織中的表達上調(diào)[11,12]。CLU的表達由癌基因和癌蛋白共同調(diào)節(jié)，與轉(zhuǎn)移表型相關(guān)，其作用機理是調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、VEGF 和E- 鈣粘蛋白的表達[13,14]。鼻咽癌是具有高轉(zhuǎn)移性臨床病理特征的腫瘤。有研究表明，CLU 與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)，DNP 可增加CLU、 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9 和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，DNP 通過上調(diào)CLU 可進一步增加MMP-9 和VEGF 的表達。同時DNP 也增加CLU 與MMP-9 或VEGF的結(jié)合，CLU、MMP-9 和VEGF 與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分類呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，DNP 可能通過上調(diào)CLU，MMP-9 和VEGF 的表達來促進鼻咽癌腫瘤組織的轉(zhuǎn)移。因此，升高的CLU 表達可能是鼻咽癌高轉(zhuǎn)移的重要因素，而CLU 可以作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的生物標志物[15]。

MMP3 與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)，單獨發(fā)生MMP3 的異位表達足以增加細胞的運動性。MMP3 可以通過幾種方式促進細胞的遷移，例如，MMP3 可以裂解E- 鈣粘著蛋白，促進細胞解離，增加細胞的運動性，觸發(fā)上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，并可能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞生長因子的產(chǎn)生[16]。角質(zhì)形成細胞生長因子是一種與細胞遷移增強有關(guān)的分泌蛋白[17]。Zta 是Epstein-Barr 病毒（EBV）的裂解性反式激活因子，目前已被證明可促進上皮細胞的遷移和侵襲[18]。Zta 因子可直接靶向MMP3 和MMP9 的啟動子，還可誘導(dǎo)MMP3 與MMP9 的表達。Zta 誘導(dǎo)細胞遷移的過程需要MMP3，但不需要MMP9。體外實驗表明，MMP3 和MMP9都有助于Zta 誘導(dǎo)細胞侵襲。Zta 的表達與鼻咽癌的頸部轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]。亞網(wǎng)絡(luò)A 中的PAX5 目前已被證明是EBV 依賴的細胞增殖的主要參與者，并且先前被鑒定為裂解性EBV活化的抑制劑[20]，與病毒侵入及增殖密切相關(guān)。

亞網(wǎng)絡(luò)B 中的FN1 基因是ECM 糖蛋白家族的成員，在細胞粘附、遷移極性和組織重塑中可起到關(guān)鍵的作用。FN1也有利于維持微血管的完整性和抗感染性[21]。此外，最近已證實FN1 與各種癌癥中的細胞轉(zhuǎn)移、分化和粘附密切相關(guān)，并且FN1 的下調(diào)會抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。FN1 的下調(diào)可以抑制食管癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖。有人指出，減毒的FN1 可以有效抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移[22-23]。相關(guān)的研究表明，通過抑制FN1 來使AKT 信號通路失活[24]，可減少鼻咽癌病灶中發(fā)生的腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成。AKT信號通路在調(diào)節(jié)正常細胞和癌細胞的存活、增殖、凋亡和營養(yǎng)代謝等過程中均能起到至關(guān)重要的作用[25]。先前的研究表明，AKT 信號通路在鼻咽癌的惡化過程中起著關(guān)鍵的作用，而AKT 信號通路的下調(diào)可抑制鼻咽癌細胞的發(fā)育，抑制AKT 信號通路的激活則可抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。此外，F(xiàn)N1 的過表達還與潛伏膜蛋白1 的表達有關(guān)，對鼻咽癌患者具有獨立的預(yù)后評估價值[27]。

本研究的結(jié)果證實，應(yīng)用組學(xué)技術(shù)可以揭示腫瘤發(fā)生的復(fù)雜分子事件及控制重要的腫瘤行為，如腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和對治療耐受等。鼻咽癌的發(fā)生與多種因素密切相關(guān)，相關(guān)因素包括病毒侵襲、基因表達異常、細胞增殖及信號通路激活。從多基因水平探討鼻咽癌的可能發(fā)病機制，可以為鼻咽癌的早期診斷、治療研究提供潛在的科研線索。