張俊

（六枝特區(qū)疾病預(yù)防控制中心，貴州 六枝 553400）

0 引言

民以食為天，食品安全是國(guó)家和人民從古自今都十分關(guān)心關(guān)注的民生問(wèn)題。食品微生物檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定是食品檢驗(yàn)的最基本的要求之一，其方法的精準(zhǔn)程度可以更好地反映食品被微生物污染的程度，市場(chǎng)工作人員可以根據(jù)微生物的檢驗(yàn)結(jié)果判斷食品是否滿(mǎn)足市場(chǎng)流通的需求[1]。菌落總數(shù)測(cè)定紙片法在一定程度上可以幫助研究人員及市場(chǎng)管理人員得到更為精準(zhǔn)的食品樣本微生物檢驗(yàn)結(jié)果，提供檢驗(yàn)的真實(shí)性，為后續(xù)的食品管理工作打下基礎(chǔ)[2]。

1 資料及方法

1.1 一般資料。選擇國(guó)家食品監(jiān)測(cè)項(xiàng)目2019年1月至2020年8月的40例食品樣本作為檢驗(yàn)對(duì)象，分別使用菌落總數(shù)測(cè)定紙片法以及瓊脂傾注平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)量食品微生物檢驗(yàn)菌落總數(shù)。將菌落總數(shù)測(cè)定紙片法設(shè)置為研究組、瓊脂傾注平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)法設(shè)置為參照組。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂傾注平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（參照組）

（1）術(shù)語(yǔ)和定義：菌落總數(shù)是指食品樣品經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成份、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH值、需氧程度等），所得1 mL（g）食品檢樣中所含菌落數(shù)。

（2）設(shè)備和材料：恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃）、天平、恒溫水浴箱（36±1℃）、均質(zhì)器、無(wú)菌吸管及培養(yǎng)皿、放大鏡、無(wú)菌生理鹽水等。

（3）培養(yǎng)基：使用上?？禎?rùn)生物科技有限公司生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂成品，按要求配制、滅菌后備用。

（4）樣品處理：取樣品25 mL（g）放入含有225 mL滅菌磷酸緩沖液稀釋液（或生理鹽水）的取樣罐或均質(zhì)杯內(nèi)，制成1:10的樣品勻液，必要時(shí)用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)樣品勻液pH至6.6～7.2。用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1 mL，注入含有9 mL稀釋液的試管內(nèi)，振搖后成為1:100的樣品勻液，以此類(lèi)推，做出1:1000等稀釋度的樣品勻液，每次換一支吸管。

（5）操作：研究人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的具體內(nèi)容，將食品樣本根據(jù)采樣環(huán)境、食品來(lái)源等評(píng)估可能的污染程度和檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)要求，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪?。吸取稀釋?ml放置在滅菌平皿中，不同稀釋度至少做兩個(gè)平行樣，避免誤差存在導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不真實(shí)。

研究人員需要等待營(yíng)養(yǎng)瓊脂充分冷卻，溫度控制在46℃左右時(shí)傾注平皿。在制作傾注平皿時(shí)，需要將裝滿(mǎn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的容器放置在（46±1）℃水浴箱內(nèi)保溫。因?yàn)闇囟鹊淖兓瘯?huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)出現(xiàn)不同延遲，導(dǎo)致最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不真實(shí)，即溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的正常生長(zhǎng)繁殖受到抑制，過(guò)低會(huì)因瓊脂凝固不能與菌液完全融合導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)供給而阻礙細(xì)菌的正常生長(zhǎng)。

傾注時(shí)以10公分平皿注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂15～18 mL為宜，過(guò)厚會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的觀察結(jié)果誤差增大，過(guò)薄會(huì)增加瓊脂自身發(fā)生干裂的可能性。傾注后研究人員需要緩慢均勻轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，確保平皿內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂與樣品充分混合均勻。同時(shí)做空白對(duì)照：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿中，然后取出不含樣品1 mL稀釋液滴加在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。待營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固之后，將其翻轉(zhuǎn)放置在（36±1）℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（48±2）h。

（6）計(jì)數(shù)：時(shí)間滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求之后，取出傾注平皿計(jì)算菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，將菌落數(shù)目乘以稀釋倍數(shù)得到最終的樣品所含菌落總數(shù)。

1.2.2 菌落總數(shù)測(cè)定紙片法（研究組）

（1）原理及適用范圍：菌落總數(shù)是指樣品經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1 mL（g）檢樣或單位面積樣品中所含菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基產(chǎn)品，含有標(biāo)準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，冷水可溶性的吸水凝膠和脫氫酶指示劑氯化三苯基四氮唑（TTC），菌落在測(cè)試片上呈紅色。

（2）測(cè)定試紙：使用廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司生產(chǎn)的“食品、飲用水菌落測(cè)定試紙片”，品牌為綠洲生化、規(guī)格為24片/包，產(chǎn)品存放于4℃～10℃冰箱中，保質(zhì)期為一年，鋁箔袋打開(kāi)后,未用完的紙片要放回鋁箔袋中封好，放到冰箱中，一個(gè)月內(nèi)用完，試紙符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定（GB 4789.2）要求。

（3）操作方法。①樣品處理：與平皿計(jì)數(shù)法共用。②操作：將菌落總數(shù)測(cè)試片（BB202）置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開(kāi)上層膜，用無(wú)菌吸管吸取1 mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10 s左右使培養(yǎng)基凝固，每個(gè)稀釋度接種兩片。同時(shí)做空白對(duì)照。③培養(yǎng)：將測(cè)試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)12片，培養(yǎng)15～24h。④結(jié)果判讀：細(xì)菌在測(cè)試片上生長(zhǎng)后會(huì)顯示紅色斑點(diǎn)，選擇菌落數(shù)適中（30～300個(gè)）的測(cè)試片進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后即為每毫升（或每克）樣品中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。

1.3 指標(biāo)判定。肉眼或用放大鏡觀察平皿和試紙上的菌落總數(shù)結(jié)果，多次計(jì)數(shù)并作記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將收集到40例食品樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的分析（采用SSPS 26.0軟件分析），40例食品樣本的計(jì)數(shù)資料以%表示，例n表示，采用χ2檢驗(yàn)。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終結(jié)果為P＜0.05，此次的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)比兩組40例食品樣本的菌落總數(shù)結(jié)果，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 兩組40例食品樣本的菌落總數(shù)結(jié)果情況比較[n（%）]

3 討論

菌落是在細(xì)菌培養(yǎng)之后生長(zhǎng)繁殖在固體培養(yǎng)基上，且能肉眼可以看見(jiàn)的生長(zhǎng)物，當(dāng)食物樣本被研究人員選擇適當(dāng)?shù)南♂尪冗M(jìn)行相關(guān)操作的時(shí)候，同時(shí)將稀釋液與培養(yǎng)基混合，滿(mǎn)足細(xì)菌正常生長(zhǎng)條件并培養(yǎng)一段時(shí)間之后，基本上每一種適宜環(huán)境的細(xì)菌都可以在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落[3]。研究人員在實(shí)際傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂的時(shí)候，一旦發(fā)現(xiàn)培基底部存在不明原因的沉淀物，則不能將沉淀物一同傾倒在傾注皿內(nèi)，需要將存在不明原因的沉淀物棄去，避免后續(xù)操作過(guò)程中沉淀物的存在對(duì)菌落計(jì)數(shù)觀察的結(jié)果帶來(lái)負(fù)面影響。

瓊脂傾注平皿培養(yǎng)計(jì)數(shù)法受時(shí)間、溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)條件以及需氧影響，需氧菌生長(zhǎng)受影響不會(huì)很大，而微需氧菌、厭氧菌以及生長(zhǎng)要求較為特殊的細(xì)菌，由于當(dāng)前的規(guī)定生長(zhǎng)要求不滿(mǎn)足其最佳的生長(zhǎng)繁殖要求，所以其不能真正的有效繁殖，所以菌落總數(shù)并不是真正可以代表營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上完全存在的所有細(xì)菌總數(shù)，同樣，也不能根據(jù)肉眼可見(jiàn)的菌落數(shù)目對(duì)不同的細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行區(qū)分以及鑒別[4-5]。在實(shí)際食品樣品檢驗(yàn)過(guò)程中，其結(jié)果不能支持食品檢驗(yàn)工作人員順利開(kāi)展有效工作。研究人員在進(jìn)行不同菌種的食品微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，需要首先明確自身需要測(cè)量的菌種，根據(jù)所需測(cè)量菌種的實(shí)際培養(yǎng)繁殖所需要的條件進(jìn)行及時(shí)的確定，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)控制的條件符合該細(xì)菌的生長(zhǎng)要求[6-7]。

菌落總數(shù)測(cè)定紙片法被食品管理部門(mén)人員用來(lái)快速檢驗(yàn)食品被細(xì)菌污染的程度。在實(shí)際食品檢驗(yàn)過(guò)程中，研究人員收集一系列食品樣本，根據(jù)上述研究?jī)?nèi)容的具體操作進(jìn)行適當(dāng)科學(xué)的操作，在對(duì)應(yīng)的時(shí)間內(nèi)就可以得到食品中某部分菌種的污染程度。污染程度是反映食品在生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)是否符合食品安全的重要指標(biāo)之一，結(jié)果可以更好的為被檢樣品標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量，并對(duì)其做出精準(zhǔn)的衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)[8]。菌落總數(shù)測(cè)定紙片法的結(jié)果為市面上流通的食品安全管理工作提供了參考價(jià)值，提高了對(duì)食品樣品的監(jiān)測(cè)精準(zhǔn)度，保證已被檢查食物的潔凈程度[9]。比對(duì)兩組檢驗(yàn)結(jié)果，研究組的菌落總數(shù)結(jié)果明顯比參照組更為精準(zhǔn)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，食品樣本的菌落總數(shù)測(cè)定紙片法在一定程度上可以更好的提高食品微生物檢驗(yàn)的精準(zhǔn)程度，得到更為快捷、真實(shí)的檢測(cè)結(jié)果。