何玲玲 孫亮亮 俞曉雲(yún) 李睿彥 王海琳

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是全球女性最具威脅生命的惡性腫瘤之一，在女性常見惡性腫瘤中位居第七，癌癥相關(guān)死亡中位居第八位，5年生存率低于45%[1]。由于卵巢位于骨盆內(nèi)，位置隱匿，早期無癥狀，導(dǎo)致大多患者確診時(shí)為晚期，即使初診時(shí)行手術(shù)治療聯(lián)合足療程化療，多數(shù)患者仍在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者由于經(jīng)歷多次化療而對(duì)化療藥物耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[2]?；熌退幣c細(xì)胞信號(hào)通路在分子水平上的激活有關(guān)，明確OC耐藥發(fā)生的分子機(jī)制并進(jìn)行靶向干預(yù)，可能是克服OC耐藥并改善患者預(yù)后的有效途徑。外泌體(Exosomes)是由多種細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微囊，大小在40～150 nm[3]。外泌體含有多種生物活性物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，它通過釋放生物活性物質(zhì)，與受體細(xì)胞膜融合或細(xì)胞表面受體結(jié)合，在細(xì)胞間的信息交流中起著重要作用。研究表明，外泌體與多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間化療耐藥的傳遞過程有關(guān)，如乳腺癌、前列腺癌、OC等[4]。外泌體參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響腫瘤的耐藥性，在臨床上具有作為腫瘤標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及藥物納米載體的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。本文綜述外泌體參與OC耐藥的機(jī)制及其在靶向治療中的價(jià)值，為今后OC靶向治療的研究提供新思路。

1 外泌體與OC

卵巢腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境均與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及胞外囊泡組成。缺氧是促進(jìn)上皮性腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵因素。卵巢腫瘤本質(zhì)上處于缺氧微環(huán)境中，缺氧可以通過上調(diào)Rab27a、下調(diào)Rab7、溶酶體相關(guān)膜蛋白1和2(LAMP1/2)、神經(jīng)氨酸酶(NEU1)以及促進(jìn)溶酶體的分泌表型增加卵巢癌外泌體的釋放[6]。存在于OC微環(huán)境中的外泌體通過與受體細(xì)胞膜相互作用參與OC的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、免疫反應(yīng)和化療耐藥[7]。

1.1 外泌體調(diào)控腫瘤微環(huán)境 OC不同于其他惡性腫瘤的是具有一個(gè)特定的腫瘤微環(huán)境，腹水在OC擴(kuò)散中起著重要作用[8]。>1/3的OC患者確診時(shí)伴有腹水，幾乎復(fù)發(fā)患者均有腹水[9]。惡性腹水富含細(xì)胞因子、生長因子及各種促炎和免疫抑制因子，共同形成促進(jìn)腫瘤生長的微環(huán)境，并介導(dǎo)對(duì)化療藥物的耐藥[10]。腹水中的外泌體通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Cho等[11]證明OC來源的外泌體可以誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSC)表現(xiàn)出腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)的典型特征，并通過增加轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的分泌激活SMAD依賴性途徑和非SMAD依賴性途徑從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展及侵襲。此外，外泌體中的miRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)在OC進(jìn)展中發(fā)揮作用。OC來源的外泌體可以將miR-222-3p轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞，通過SOCS3/STAT3通路誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMS)產(chǎn)生,促進(jìn)OC細(xì)胞增殖、血管生成、免疫抑制、侵襲及轉(zhuǎn)移[12,13]?？傊?，OC來源的外泌體參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

1.2 外泌體調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng) 腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的動(dòng)態(tài)相互作用參與了OC化療耐藥及腫瘤進(jìn)展。腫瘤來源的外泌體通過幾種不同的機(jī)制抑制免疫系統(tǒng)。腹水來源的外泌體可被單核細(xì)胞攝取，激活TOLL樣受體(TLR)依賴的信號(hào)通路，誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子分泌增加，從而導(dǎo)致免疫抑制[14]。此外，腫瘤來源的外泌體可以促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞的分化來增強(qiáng)免疫抑制，包括骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)、TAMS和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)。MDSC可以負(fù)性調(diào)控抗原的加工和呈遞，促進(jìn)免疫抑制因子的分泌，抑制免疫應(yīng)答[15,16]。外泌體還可通過Fas/FasL誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡或通過NKG2D配體下調(diào)NK細(xì)胞活性[17,18]。外泌體對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)是相當(dāng)復(fù)雜的，了解它們相互作用的機(jī)制能為腫瘤的治療提供一種新視野。

2 外泌體參與OC耐藥的機(jī)制

目前，化療耐藥是腫瘤治療面臨的主要挑戰(zhàn)，闡明腫瘤發(fā)生和耐藥的分子機(jī)制對(duì)研究腫瘤治療新策略至關(guān)重要。外泌體參與OC耐藥的機(jī)制包括傳遞耐藥相關(guān)miRNA至受體細(xì)胞調(diào)節(jié)基因表達(dá)、通過藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度和誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來誘導(dǎo)化療耐藥。

2.1 外泌體通過轉(zhuǎn)移耐藥相關(guān)miRNA誘導(dǎo)OC耐藥 近年來外泌體中的microRNA(miRNA) 在OC耐藥中的作用備受關(guān)注。miRNA是由19-25個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，能調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，在OC耐藥中發(fā)揮重要作用。外泌體在細(xì)胞間傳遞耐藥相關(guān)miRNA誘導(dǎo)化療耐藥。Au Yeung等[19]研究表明癌癥相關(guān)脂肪細(xì)胞(CAA)和CAF來源的外泌體高度表達(dá)miR-21,并通過抑制凋亡蛋白酶激活因子1(AFAP1)抑制OC細(xì)胞凋亡，并且通過靶向TGF信號(hào)通路間接上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)，這可能導(dǎo)致OC細(xì)胞侵襲能力增加，誘導(dǎo)OC細(xì)胞化療耐藥。研究表明，缺氧的OC細(xì)胞引導(dǎo)巨噬細(xì)胞募集并誘導(dǎo)其成為TAM樣表型，它釋放的外泌體富含miR-233,并可轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)的OC細(xì)胞中，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性及惡性表型，miR-233在體內(nèi)外均通過PTEN-PI3K/AKT途徑促進(jìn)OC細(xì)胞的耐藥性，并且外周循環(huán)中miR-233 的水平與OC的復(fù)發(fā)密切相關(guān)[20]。此外，OC細(xì)胞表達(dá)的miR-433通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(CKD6)和誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來促進(jìn)OC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性[21]。Guo等[22]研究表明CAF分泌的外泌體富含miR98-5p,它可以通過靶向抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，并介導(dǎo)OC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。當(dāng)然，外泌體中的某些microRNA能夠降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。Liu等[23]研究表明對(duì)順鉑耐藥的OC細(xì)胞來源的外泌體中的miR-30a-5p在體內(nèi)外均能通過下調(diào)SOX9表達(dá)，增加OC細(xì)胞的凋亡從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，而耐藥OC細(xì)胞中的miR-30a-5p表達(dá)明顯降低，因此含有miR-30a-5p的外泌體可能是OC耐藥的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)?？梢钥闯?，外泌體中的miRNA對(duì)OC化療耐藥的調(diào)控是極其復(fù)雜的，除了上述miRNA外，外泌體中的其他miRNA也可能參與了OC的化療耐藥，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明它們參與耐藥的分子機(jī)制。

2.2 外泌體通過輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)OC耐藥 外泌體中除了miRNA外還有多種蛋白質(zhì)，已有研究證明蛋白質(zhì)與OC耐藥的關(guān)系，提示外泌體可以通過輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來誘導(dǎo)OC耐藥。藥物代謝分子和某些蛋白質(zhì)由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體釋放到細(xì)胞外環(huán)境。Safaei等[24]的研究發(fā)現(xiàn)鉑耐藥的OC細(xì)胞釋放的外泌體中鉑含量是鉑敏感細(xì)胞的2.6倍，同時(shí)鉑耐藥細(xì)胞分泌的外泌體釋放更多的順鉑輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)、銅離子轉(zhuǎn)出蛋白A(ATP7A)、銅離子轉(zhuǎn)出蛋白B(ATP7B)和LAMP1。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Ca2+和磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族的成員Annexin a3在鉑耐藥OC細(xì)胞系中明顯增加，它可能通過阻止細(xì)胞對(duì)鉑的攝取或累積介導(dǎo)OC耐藥，Annexin a3的分泌可能與胞吐作用及外泌體的釋放有關(guān)，并且表達(dá)較高水平Annexin a3的OC細(xì)胞分泌更多的外泌體[25,26]。

P-糖蛋白(p-gp)是由多藥耐藥基因1(MDR-1)編碼的170 kDa的蛋白，參與多種腫瘤的耐藥。P-gp通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物的排出降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度介導(dǎo)化療耐藥。Zhang等[27]研究表明在膜結(jié)合蛋白水平上，p-gp通過微囊的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)在人OC細(xì)胞間“共享”。與野生型親本系相比(A2780/WT)相比，紫杉醇耐藥的人OC(A2780/PTX)更容易形成并釋放含有更多p-gp的微囊。微囊以時(shí)間和劑量依賴性方式與化療敏感的A2780/WT細(xì)胞結(jié)合，微囊介導(dǎo)的p-gp轉(zhuǎn)移致受體細(xì)胞(A2780/WT)對(duì)阿霉素和紫杉醇耐藥性均提高5倍。微囊和外泌體均屬于細(xì)胞外囊泡，外泌體p-gp已被證明可以誘導(dǎo)乳腺癌的耐藥，因此外泌體也可能通過轉(zhuǎn)移p-gp誘導(dǎo)OC耐藥[28]。此外，外泌體中也富含甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)，它在DNA復(fù)制和修復(fù)過程維持全基因組的甲基化中有著重要作用，DNA的甲基化通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與腫瘤耐藥。Cao等[29]用順鉑處理SKOV3細(xì)胞，未暴露于外泌體的SKOV3細(xì)胞的凋亡率明顯高于暴露組，而外泌體抑制劑GW4869能恢復(fù)耐藥細(xì)胞的敏感性。綜上所述，腫瘤微環(huán)境中的外泌體可以通過攜帶各種輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)OC耐藥。

2.3 外泌體通過誘導(dǎo)EMT誘導(dǎo)OC耐藥 EMT是指從上皮細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，EMT可賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，包括獲得干細(xì)胞特征、減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)免疫抑制。EMT是腫瘤免受細(xì)胞毒藥物作用的耐藥機(jī)制之一[30]。Crow等[31]用耐藥OC A2780的衍生細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體處理A2780細(xì)胞,結(jié)果顯示上皮性標(biāo)志物dystroglycan、E-cadherin和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)表達(dá)明顯下降，而間充質(zhì)標(biāo)志物paladin、TWIST、和Vimentian明顯上調(diào)。Li等[32]研究表明CAF分泌的外泌體中TGFβ1明顯上調(diào)，并通過激活SMAD信號(hào)通路促進(jìn)卵巢腫瘤的EMT，增加OC的耐藥性及侵襲性。Yew等[33]研究發(fā)現(xiàn)表皮形態(tài)發(fā)生素(Epimorphin)可以逆轉(zhuǎn)OC的EMT,使OC細(xì)胞可以從間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化為上皮表型，從而增強(qiáng)對(duì)一線化療藥物的敏感性?？傊饷隗w通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生EMT的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征參與OC化療耐藥，逆轉(zhuǎn)EMT可能可以提高OC細(xì)胞的敏感性。見圖1。

圖1 外泌體誘導(dǎo)OC耐藥的機(jī)制

3 外泌體在OC耐藥患者治療中的臨床價(jià)值

外泌體通過多種生物學(xué)機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著人們對(duì)外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用的了解，人們正在研究和開發(fā)外泌體在OC治療領(lǐng)域的應(yīng)用，如調(diào)節(jié)外泌體的分泌、利用外泌體增強(qiáng)抗腫瘤免疫、利用外泌體的歸巢效應(yīng)以及將外泌體作為運(yùn)輸藥物的載體，這些研究為OC患者的治療帶來了新的希望。

3.1 調(diào)節(jié)外泌體的產(chǎn)生及釋放 外泌體與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在OC的治療中，有多種靶向外泌體或利用外泌體的選擇。近年來利用外泌體進(jìn)行治療的研究主要集中在腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的功能上。CAF來源的外泌體可以抑制OC胞凋亡并通過TGF信號(hào)通路促進(jìn)OC細(xì)胞的侵襲、遷移和耐藥[19]，因此，抑制腫瘤微環(huán)境中CAF釋放外泌體可用于治療OC。研究表明，用腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK)處理的巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過上調(diào)miR7的表達(dá)抑制OC受體細(xì)胞中EGFR/AKT/ERK1/2信號(hào)通路進(jìn)而抑制OC的轉(zhuǎn)移，提示TWEAK刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體miR7在OC的治療中有良好的應(yīng)用前景[34]?？梢钥闯?，不同細(xì)胞來源的外泌體對(duì)腫瘤進(jìn)展過程中的調(diào)節(jié)作用是不同的，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞分泌的外泌體釋放可能是治療OC的有效途徑。見表1。

表1 通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的外泌體治療OC的途徑

3.2 利用外泌體促進(jìn)OC的治療

3.2.2 外泌體作為運(yùn)輸藥物的載體:目前，化療仍然是治療腫瘤的主要方式?；熕幬锏慕o藥方式和耐藥機(jī)制一直是腫瘤化療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。過去開發(fā)的用于腫瘤治療的靶向藥物控釋系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體和納米顆粒聚合物，增加了給藥特異性，減少了藥物降解并延長了藥物釋放時(shí)間。但這些藥物運(yùn)輸載體能引起嚴(yán)重副作用，包括器官毒性和免疫反應(yīng)?；熌退幨悄[瘤患者的常見死亡原因。改進(jìn)化療藥物的給藥方式和克服化療耐藥是治療腫瘤的關(guān)鍵方式。近年來，作為天然納米顆粒的外泌體被用作載有合成化學(xué)藥物或特定重組分子的藥物運(yùn)輸載體。與現(xiàn)有藥物運(yùn)輸載體相比，外泌體作為藥物運(yùn)輸載體的優(yōu)勢(shì)是有較低的免疫原性和毒性，較高的循環(huán)和組織穩(wěn)定性以及固有的歸巢能力[43]。Zhang等[44]用臍帶血單核M1巨噬細(xì)胞來源的外泌體負(fù)載順鉑分別處理鉑敏感A2780細(xì)胞和鉑耐藥A2780/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示鉑敏感A2780細(xì)胞和鉑耐藥A2780/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用分別提高1.4倍和3.3倍；用臍帶血M2來源的外泌體負(fù)載順鉑處理上述兩種細(xì)胞，結(jié)果顯示M2巨噬細(xì)胞來源的外泌體使順鉑對(duì)鉑敏感A2780細(xì)胞和鉑耐藥A2780/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用分別提高1.4倍和1.7倍，可以看出，無論OC耐藥性如何，負(fù)載順鉑的臍帶血M1來源的外泌體能有效提高順鉑的細(xì)胞毒性，這種作用可能是由外泌體在腫瘤細(xì)胞中的優(yōu)先累積和M1巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用介導(dǎo)的。

通過簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶(Cas)9進(jìn)行基因編輯是抗腫瘤研究中的重要工具 ，有必要開發(fā)一種能有效的將其運(yùn)送至細(xì)胞的載體。Kim等[36]研究表明與上皮細(xì)胞來源的外泌體相比，腫瘤來源的外泌體能選擇性地在SKOV3異種移植小鼠的卵巢腫瘤中積聚，攜帶CRISPR/Cas的腫瘤來源的外泌體能抑制聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)OC細(xì)胞的凋亡。此外CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯對(duì)PARP-1的抑制增強(qiáng)了OC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。雖然多種植物提取物在各種癌癥中有抗腫瘤作用，但由于缺乏有效的運(yùn)輸載體而限制了其臨床應(yīng)用。有研究表明外泌體作為運(yùn)輸漿果花色苷的載體，可以提高該藥在治療OC方面的生物利用度，有效抑制OC的生長[45]?？偟膩碚f，外泌體作為運(yùn)輸治療藥物的載體能明顯提高藥物對(duì)OC的治療效果，為OC患者的治療帶來了新的希望。

3.2.3 利用外泌體對(duì)癌細(xì)胞的歸巢效應(yīng)促進(jìn)OC治療:卵巢癌分泌的外泌體通過免疫抑制、血管生成、基質(zhì)細(xì)胞重塑和癌基因重新編程誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。轉(zhuǎn)移前生態(tài)位是腫瘤在廣泛轉(zhuǎn)移前分泌的外泌體所形成的微環(huán)境[46]。利用外泌體對(duì)原代癌細(xì)胞的歸巢作用可以作為OC治療的靶點(diǎn)。De la Fuente等[47]研究表明將OC腹水來源的外泌體嵌入到工程生物材料中并植入到小鼠腹腔，能產(chǎn)生模擬的人工轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。該模擬轉(zhuǎn)移前生態(tài)位能有效的從腹水中招募游離OC細(xì)胞，從而阻止OC細(xì)胞向正常的盆腔臟器轉(zhuǎn)移，顯著提高生存率?？梢钥吹?，這種靶向技術(shù)將會(huì)是未來腫瘤治療研究的新領(lǐng)域。

OC嚴(yán)重威脅女性健康，早期診斷困難、轉(zhuǎn)移率高和化療耐藥是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。外泌體作為腫瘤微環(huán)境中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體，在OC的發(fā)生發(fā)展、耐藥及免疫抑制中起著重要作用。外泌體通過轉(zhuǎn)移耐藥相關(guān)miRNA、藥物輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及誘導(dǎo)EMT促進(jìn)OC的化療耐藥。了解不同細(xì)胞來源的外泌體在OC耐藥及其發(fā)展過程中發(fā)揮作用的分子學(xué)機(jī)制，有助于我們?cè)贠C治療中開發(fā)針對(duì)外泌體的靶向治療的新方法，比如抑制OC來源的外泌體釋放、利用外泌體攜帶的TAA增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)、利用外泌體的歸巢效應(yīng)和外泌體天然納米顆粒的特性作為藥物運(yùn)輸?shù)妮d體。