王殿一 武峙璇

喉返神經(jīng)損傷主要發(fā)生在甲狀腺手術中，是其常見的并發(fā)癥，通過擠壓、橫斷、結扎等多種途徑均能導致喉返神經(jīng)損傷。相關研究認為，喉返神經(jīng)損傷，會因為帶麻痹導致患者的聲音產(chǎn)生嘶啞、嗆咳，嚴重的患者會出現(xiàn)窒息，威脅生命[1]。輕度的喉返神經(jīng)損傷會自行恢復，但是嚴重的喉返神經(jīng)損傷會導致永久性麻痹。喉返神經(jīng)損傷發(fā)病原因相對復雜，解剖結構較深[2]，因此尋找積極有效的關于喉返神經(jīng)損傷診斷、治療方案對患者具有重要作用。人第10號染色體缺失的磷酸及張力蛋白同源基因(phosphatase andtensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)屬于內(nèi)源性PI3K抑制劑，主要在神經(jīng)元細胞核、細胞體、再生軸突中表達。有研究顯示，通過抑制PTEN活性，有助于外周神經(jīng)生長[3]。PTEN敲除后，通過調(diào)控PI3K/Akt外周神經(jīng)修復信號通路，參與皮質(zhì)脊髓神經(jīng)再生過程[4]。本文研究下調(diào)PTEN表達對喉返神經(jīng)擠壓損傷模型大鼠干預作用及可能的相關機制，為臨床治療喉返神經(jīng)擠壓損傷提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取40只健康清潔級雄性大鼠，鼠齡6～9周，平均鼠齡(8.5±0.5)周；體重200～260 g，平均體重(230.6±15.5)g；由上海市第一人民醫(yī)院動物實驗中心提供[動物許可證號：SYXK(滬)2009-0086]。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子里，3～5只為1籠，室溫22～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲食和飲水，飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器 PTEN腺病毒(上海賽業(yè)生物技術有限公司)；3%的戊巴比妥鈉、PBS、Ficoll液(上海利康消毒高科技有限公司)；纖維喉鏡(日本奧林巴斯)；SYBRPremixExTaq熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin一抗(美國NEB)；10%甲醛、凝膠緩沖液、TBST(上海生工生物技術有限公司)；透射電鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.3 方法

1.3.1 喉返神經(jīng)擠壓損傷模型建立:參考吳濤等[5]的方法，將40只大鼠隨機抽取30只，使用3%的40 mg/kg戊巴比妥鈉給予腹腔麻醉，放置在無菌手術操作臺上，對手術部位進行常規(guī)消毒。在大鼠頸部正中位置做切口，長度為2 cm，皮膚切開后將帶狀肌分離后，甲狀腺、雙側氣管食管溝完全暴露，通過顯微鏡引導在大鼠甲狀腺右側下5 mm位置，沿著心臟方向，將喉返神經(jīng)輕柔游離7 mm。采用微血管夾對大鼠游離的喉返神經(jīng)中間5 mm擠壓2 min。微血管夾取出后，將傷口關閉。手術后對大鼠進行保暖，分籠喂養(yǎng)。死亡3只，剩余27只，分為模型組、下調(diào)組、上調(diào)組，每組9只。另外10只分為假手術組，進行常規(guī)麻醉后，將喉返神經(jīng)游離后將手術切口閉合，不做其他處理。

1.3.2 建立下調(diào)PTEN慢病毒表達載體:下調(diào)組為PTEN腺病毒為腺病毒介導，瞬時轉染均由(上海賽業(yè)生物技術有限公司合成)。PTEN下調(diào)序列：GATCT TGACCAATGG CTAATTCAAG AGATTAGCCA TTGGTCAAGA TC。PTEN上調(diào)序列：GCCAG CTAAAGGTGA AGATTTCAAG AGAATCTTCA CCTTTAGCTG GC。將病毒溶液按照一定的比例對細胞進行轉染，培養(yǎng)16 h后將原有的培養(yǎng)基去除，使用PBS清洗干凈再次更換培養(yǎng)基，觀察轉染情況。通過微量加樣器提取適量的病毒溶液，在大鼠神經(jīng)損傷局部注射。假手術組和模型組不進行注射。

1.3.3 PTEN mRNA表達檢測:定量PCR檢測PTEN mRNA基因表達 采集空腹靜脈血液樣本5 ml，置于一次性真空無抗凝劑的采血管中，使用Ficoll液分離單個核細胞。TRIzol提取細胞RNA，經(jīng)過電泳檢測RNA并定量，經(jīng)過逆轉錄合成cDNA。之后進行實時熒光定量PCR實驗，探針或SYBR 反應25 μl，反應條件滿足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40個循環(huán),設置標準組和空白對照。將PCR反應實驗前3～15個循環(huán)熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線，采用2-ΔΔCt分析PTEN mRNA表達。

1.3.4 杓狀軟骨運動角度檢查:主要在纖維喉鏡下通過截圖觀察大鼠杓狀軟骨間夾角(杓間角)，即最大開放角度，采用PSCC軟件分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3.5 聲學改變、甲杓肌神經(jīng)誘發(fā)電位圖、喉返神經(jīng)纖維觀察:應用肌電圖/誘發(fā)電位儀，將大鼠喉返神經(jīng)游離后，使用同心針電極選擇大鼠右側甲狀軟骨板前中1/3的位置下緣內(nèi)側1 mm處進針，刺激電極，記錄4組大鼠聲學圖和甲杓肌神經(jīng)誘發(fā)電位圖。通過透射電鏡檢查4組大鼠喉返神經(jīng)纖維。

1.3.6 病理組織觀察:將大鼠腹腔麻醉后，斷頭處死后，快速提取大鼠甲杓肌及環(huán)杓后肌，去除包膜，在0.9%氯化鈉溶液中漂洗，在10%甲醛中固定24 h，制作病理組織切片，HE染色。

1.3.7 PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達:采用Western blot檢測，將采集到的標本10 000×g離心處理10 min，對上清液進行提取后，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉膜，取膜，4℃環(huán)境下5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結果

2.1 4組大鼠PTEN mRNA表達比較 與假手術組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組PTEN mRNA表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組PTEN mRNA表達降低，上調(diào)組PTEN mRNA表達升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組PTEN mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠PTEN mRNA表達比較

2.2 下調(diào)PTEN對大鼠杓狀軟骨運動角度的影響 與假手術組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組杓狀軟骨運動最大角度降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組杓狀軟骨運動最大角度升高，上調(diào)組杓狀軟骨運動最大角度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組杓狀軟骨運動最大角度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠杓狀軟骨運動角度比較

2.3 下調(diào)PTEN對大鼠聲學改變的影響 假手術組和下調(diào)組大鼠發(fā)出尖銳的高叫聲，高振幅持續(xù)較好的波形；模型組和上調(diào)組大鼠發(fā)出聲音嘶啞，振幅較小且不穩(wěn)定的窄波。見圖1。

2.4 下調(diào)PTEN對大鼠甲杓肌神經(jīng)誘發(fā)電位圖的影響 模型組甲杓肌神經(jīng)誘發(fā)電位波幅(0.73±0.16)V與上調(diào)組(0.59±0.17)V、假手術組(2.53±0.85)V、下調(diào)組(3.03±0.96)V比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組潛伏期(1.00±0.02)ms與上調(diào)組(0.98±0.01)ms、低于假手術組(0.98±0.01)ms、下調(diào)組(1.00±0.02)ms比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.5 下調(diào)PTEN對大鼠喉返神經(jīng)纖維的影響 假手術組大鼠喉返神經(jīng)纖維未發(fā)生病變，黑色箭頭表示髓鞘，白色箭頭表示雪旺細胞表現(xiàn)正常；上調(diào)組和模型組神經(jīng)纖維髓鞘釋放，脫髓鞘十分嚴重，腫脹，被巨噬細胞吞噬，神經(jīng)絲不斷溶解。下調(diào)組神經(jīng)纖維髓鞘腫脹逐漸降低，有新生髓鞘產(chǎn)生，血旺細胞被包圍。見圖3。

2.6 4組大鼠病理組織觀察 假手術組組織中肌細胞核以及肌纖維分布基本保持一致，肌纖維排列緊密，肌束分布集中，肌間隙相對較少。模型組病理組織中肌細胞核、肌纖維排列紊亂，肌間隙擴大；上調(diào)組病理組織中發(fā)現(xiàn)肌纖維萎縮，肌間隙不斷擴大，肌纖維斷裂。下調(diào)組組織中肌纖維排列逐漸恢復，肌束分布相對集中。見圖4。

2.7 下調(diào)PTEN對大鼠PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白的影響 與假手術組相比，模型組、下調(diào)組、上調(diào)組的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)組的PI3K、Akt、GSK-3β、Myogenin蛋白表達水平升高，上調(diào)組的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與下調(diào)組相比，上調(diào)組的PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖5。

表4 4組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白比較

3 討論

喉返神經(jīng)損傷均有聲帶不同位置的癱瘓，常會導致患者的吼功能、神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙，屬于耳鼻喉頭顱外科疾病，臨床中主要通過外科手術、藥物進行保守治療。喉返神經(jīng)移植修復手術能夠促進喉返神經(jīng)損傷修復，不僅需要神經(jīng)再生成功，還需要靶細胞將突觸連接重新建立，促進生理功能恢復，如果神經(jīng)再生發(fā)展較為緩慢，常會導致機體肌肉、運動萎縮，神經(jīng)恢復的結果不太理想[6,7]。因此尋找積極有效的治療手段對患者具有重要意義。

PTEN在機體中主要以未磷酸化PTEN和磷酸化pPTEN存在，其中PTEN作為內(nèi)源性PI3K抑制劑，屬于軸突再生的一種抑制信號以外周神經(jīng)元表達為主[8]。相關研究顯示，以siRNA抑制PTEN能促進成熟神經(jīng)元軸突再生長，對橫斷大鼠軸突生長也有一定的促進作用[9]。本研究結果顯示，下調(diào)組PTEN mRNA表達降低，上調(diào)組PTEN mRNA表達升高，說明下調(diào)PTEN慢病毒表達載體建立成功。喉內(nèi)肌主要是通過喉返神經(jīng)、喉上神經(jīng)支配，甲杓肌屬于喉內(nèi)肌，在患者發(fā)音、呼吸過程中具有重要作用，當喉返神經(jīng)發(fā)生損傷會影響機體肌肉[10]。有研究認為，喉返神經(jīng)損傷會導致甲杓肌失去神經(jīng)營養(yǎng)功能，對其結構、功能帶來較大的影響[11]。本文中上調(diào)組和模型組聲圖表示為小振幅窄波，下調(diào)組顯示為高振幅，說明下調(diào)PTEN能促進大鼠發(fā)音功能恢復。與徐文等[12]研究結果一致。下調(diào)組甲杓肌神經(jīng)誘發(fā)電位波幅較高，神經(jīng)纖維髓鞘腫脹逐漸降低，有新生髓鞘產(chǎn)生，說明下調(diào)PTEN能促進神經(jīng)纖維以及肌肉運動恢復。

本研究中，下調(diào)組的杓狀軟骨運動最大角度明顯升高，上調(diào)組的杓狀軟骨運動最大角度明顯降低，說明下調(diào)PTEN能夠促進杓狀軟骨運動恢復。Rosko等[13]研究指出，喉返神經(jīng)擠壓模型建立以后，隨著時間的延長，大鼠聲帶運動逐漸得到改善，說明神經(jīng)擠壓傷具有一定的自我修復能力。神經(jīng)營養(yǎng)因子的主要功能是降低神經(jīng)變性，促進軸突生長，有助于神經(jīng)分化再生，抑制疾病的發(fā)展[14]。PI3K通過誘導神經(jīng)突起向軸突分化，PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在體外軸突過程中具有重要作用[15]。相關研究指出，PI3K抑制劑通過將層粘連蛋白促進AKT-PH-GFP聚集，向神經(jīng)突起方向延伸[16]。PI3K-AKT信號通路是一個關鍵的介導神經(jīng)元的營養(yǎng)因子支持、抗凋亡的生存途徑，它不僅參與生存，而且與生長、定向分化機制都有關[17,18]。神經(jīng)生長因子與Trk受體結合，通過接頭蛋白Gab-11和RAS激活PI3K，使PI3K磷酸化并激活下游分子，分別為AKT和REK-1/2，活化AKT參與多種信號轉導通路[19-21]。

Myogenin參與失神經(jīng)骨骼肌再生過程，不僅能促進合成骨骼肌特異性胚胎性受體以及收縮蛋白，避免肌細胞凋亡過快。當神經(jīng)發(fā)生損傷CNTF會從髓鞘、雪旺細胞中被釋放，受損的軸突會直接吸收CNTF。本研究結果中，下調(diào)組PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達升高，上調(diào)組PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達降低，說明下調(diào)PTEN表達將PI3K/Akt/GSK-3β通路激活，能促進PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白表達上調(diào)，在喉返神經(jīng)修復過程中具有重要作用。

綜上所述，下調(diào)PTEN表達對喉返神經(jīng)擠壓損傷模型大鼠干預效果顯著，下調(diào)PTEN下游PI3K、Akt、GSK-3β、CNTF、Myogenin蛋白，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，參與大鼠喉返神經(jīng)修復過程，為臨床治療喉返神經(jīng)損傷提供新的研究方向。