謝 靜,程 燕,查 燕,湯 婕*,束浩然,,
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),安徽 合肥 230036;2.安徽省合肥市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,安徽 合肥 230001;3.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024)
【研究意義】富營(yíng)養(yǎng)化是自然演變的過(guò)程,隨著人類活動(dòng)的加劇使得湖泊富營(yíng)養(yǎng)化成為自然演變過(guò)程的濃縮[1]。近些年來(lái),我國(guó)各地湖泊、養(yǎng)殖池塘等淡水水體都處于富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài),其中洪澤湖、太湖、巢湖已達(dá)富營(yíng)養(yǎng)程度,鄱陽(yáng)湖和洞庭湖為中營(yíng)養(yǎng)水平[2]。富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)一步導(dǎo)致湖泊藍(lán)藻暴發(fā),并呈迅猛發(fā)展的趨勢(shì)。當(dāng)藍(lán)藻暴發(fā)時(shí),藍(lán)藻成為水體中的優(yōu)勢(shì)種,抑制其他藻類生長(zhǎng)[3],此外,藍(lán)藻水華還將導(dǎo)致水體中的溶解氧下降,導(dǎo)致大量水生生物死亡,破壞水體質(zhì)量[4]。藍(lán)藻還會(huì)釋放毒素,能夠直接危害人體健康[5]。因此,防控藍(lán)藻水華成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】大量研究表明,藍(lán)藻暴發(fā)與pH、光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽等多種因素有關(guān)[6],其中氮(N)、磷(P)營(yíng)養(yǎng)鹽是影響藍(lán)藻暴發(fā)的關(guān)鍵因子[7-9]。氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽作為防控藍(lán)藻水華的可控手段,相關(guān)學(xué)者對(duì)其如何影響藍(lán)藻生長(zhǎng)進(jìn)行了報(bào)道。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn),N、P 質(zhì)量比為200 時(shí)能夠控制藍(lán)藻生長(zhǎng),而N 質(zhì)量濃度為10 mg/L 且N、P 質(zhì)量比等于16時(shí),藍(lán)藻得到最大細(xì)胞產(chǎn)量??仔赖萚11]研究發(fā)現(xiàn)N、P 質(zhì)量濃度分別為2.65,0.53 mg/L 時(shí),銅綠微囊藻的密度達(dá)到最大值。Chen 等[12]研究發(fā)現(xiàn),總P 質(zhì)量濃度在0.1 mg/L 以上時(shí),銅綠微囊藻的繁殖速度明顯加快。此外,有機(jī)污染物也是影響藻類生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[13],如低濃度PAHs 可以作為銅綠微囊藻(Mcirocystis aeruginosa)的生長(zhǎng)促進(jìn)因子[14],其中低濃度芘脅迫下的銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到明顯促進(jìn),且pH=9.0時(shí),其生長(zhǎng)率最高[15]。李尚等[16]研究發(fā)現(xiàn)再生水中含有氮磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),景觀回用過(guò)程中可能會(huì)加劇藻類水華爆發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。許海等[17]研究發(fā)現(xiàn)太湖中溶解態(tài)有機(jī)磷濃度占比較高,有利于藍(lán)藻形成優(yōu)勢(shì)。馬浩天等[18]研究發(fā)現(xiàn)與沉水植物共培養(yǎng)條件下,斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的生長(zhǎng)受到顯著的抑制作用?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由此可見(jiàn),銅綠微囊藻和斜生柵藻作為湖泊中常見(jiàn)的藻類,由于極易繁殖,被認(rèn)為是引起水華現(xiàn)象的主要藻種[19]?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)配制不同氮磷比(質(zhì)量比)的培養(yǎng)液培養(yǎng)銅綠微囊藻和斜生柵藻,通過(guò)觀察藻細(xì)胞數(shù)及增長(zhǎng)率,探究不同氮磷比對(duì)兩種藻類在純養(yǎng)和混養(yǎng)模式下生長(zhǎng)的影響,以期為藍(lán)藻水華暴發(fā)防控提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)用銅綠微囊藻取自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所(武漢)淡水藻種庫(kù),斜生柵藻取自中山大學(xué)污染與恢復(fù)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)以BG-11 培養(yǎng)基為基礎(chǔ),先配制成無(wú)磷、無(wú)氮的培養(yǎng)基,再用硝酸鈉和磷酸氫二鉀配制成實(shí)驗(yàn)所需的氮磷比例。
在正式試驗(yàn)前進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。將饑餓培養(yǎng)的銅綠微囊藻,斜生柵藻以5 000 r/min離心5 min,去掉上清液;再用15 mg/L 的NaHCO3。溶液洗滌2 次,去掉上清液,去除吸附性的營(yíng)養(yǎng),用無(wú)菌水將藻種稀釋至接種所需的藻細(xì)胞濃度。藻種的初始密度定為5.0×104個(gè)/mL。
將經(jīng)過(guò)饑餓培養(yǎng)的銅綠微囊藻細(xì)胞,斜生柵藻分別接種到含有0,0.5,1.0,5.0,10.0 mg/L 磷(即0,3.68,7.36,36.84,73.68 mg/L 的磷酸氫二鉀)和氮元素固定在25 mg/L 的BG-11 培養(yǎng)液中,培養(yǎng)液處于以磷為標(biāo)準(zhǔn)的富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和超富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。在溫度為(25±5)℃,光照強(qiáng)度為2 000 lx,光暗比為12 h∶12 h的條件下培養(yǎng)22 d。觀察銅綠微囊藻和斜生柵藻細(xì)胞數(shù)的變化情況,用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
藻細(xì)胞增長(zhǎng)率(μ)指在某一時(shí)間間隔內(nèi)藻類生長(zhǎng)的速率。
式中:X1為某一時(shí)間間隔開(kāi)始時(shí)的銅綠微囊藻細(xì)胞現(xiàn)存量(個(gè)/mL);X2為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的銅綠微囊藻細(xì)胞現(xiàn)存量(個(gè)/mL);t2-t1為某一時(shí)間間隔(d)。
以邏輯斯諦方程擬合藻類的增長(zhǎng)過(guò)程,先進(jìn)行參數(shù)預(yù)估,以每組處理的最大生物量(Nmax)作為公式中K估計(jì)值,應(yīng)用邏輯斯諦方程的對(duì)數(shù)形式,采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析,獲得方程截距a和斜率r的估計(jì)值。
式中:N為藻類生物量;K為最大生物量;r為內(nèi)稟增長(zhǎng)率;t為培養(yǎng)時(shí)間。
種間競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)用相對(duì)生長(zhǎng)速率判別,其計(jì)算公式為[20]:
式中K為生長(zhǎng)速率常數(shù),Nt為培養(yǎng)t天后的藻密度(ind·L-1),No為藻初始密度(ind·L-1),K1為純養(yǎng)藻類時(shí)銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)速率,KA、Kc分別為純養(yǎng)時(shí)銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)速率常數(shù),K2為混養(yǎng)時(shí)銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)速率,K'A、K'c則為混養(yǎng)時(shí)二者的生長(zhǎng)速率常數(shù)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,數(shù)據(jù)處理均采用SPSS21 統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA 進(jìn)行方差分析,LSD’s多重比較檢驗(yàn)各試驗(yàn)組間是否具有顯著差異(P<0.05),圖用original 9.0繪制。
如圖1、2所示,當(dāng)N/P=(50∶1~2.5∶1)時(shí),純養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于混養(yǎng)(P<0.05)。N/P=5∶1 和N/P=25∶1 組,純養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于其他組。在5 組氮磷比下,純養(yǎng)銅綠微囊藻和斜生柵藻的最大生物量均顯著大于混養(yǎng)模式。由此可見(jiàn),兩種藻類在混養(yǎng)時(shí)有明顯的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
圖1 不同氮磷比對(duì)銅綠微囊藻最大生物量的影響Fig.1 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa
在0 mg/L 磷濃度下,兩種藻類均不能生長(zhǎng)。純養(yǎng)下,N/P=5∶1 組銅綠微囊藻的最大生物量達(dá)656×104g/mL;混養(yǎng)下,N/P=25∶1 組銅綠微囊藻的最大生物量達(dá)387×104g/mL。純養(yǎng)下,N/P=25∶1組斜生柵藻的最大生物量達(dá)462×104g/mL;混養(yǎng)下,N/P=25∶1 組斜生柵藻的最大生物量達(dá)208×104g/mL。由此可見(jiàn),在氮質(zhì)量濃度相同,不同氮磷比對(duì)兩種藻類的最大生物量均具有顯著影響(P<0.05)(圖3),并隨著磷濃度的升高,純養(yǎng)和混養(yǎng)下兩種藻類的最大生物量具有顯著性差異(P<0.05)。且無(wú)論在純養(yǎng)或混養(yǎng),銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用,其最大生物量均顯著高于斜生柵藻,究其原因,一方面由于微囊藻細(xì)胞是圓形,比斜生柵藻具有更大的比表面積,有利于吸收較多的營(yíng)養(yǎng)和光照,因此具有較高的生物量[21]。另一方面,銅綠微囊藻能夠適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏的特殊機(jī)制,在高氮磷比濃度下能夠攝取過(guò)量磷儲(chǔ)存在細(xì)胞為后續(xù)生長(zhǎng)繁殖提供能量,因此在與斜生柵藻的競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)。此外,銅綠微囊藻分泌藻毒素,對(duì)斜生柵藻產(chǎn)生的他感作用也使得其在競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)[22]。
圖2 不同氮磷比對(duì)斜生柵藻最大生物量的影響Fig.2 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Scenedesmus obliquus
圖3 不同氮磷比對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻最大生物量的影響Fig.3 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus
由圖4 可知,無(wú)論在純養(yǎng)或混養(yǎng),N/P=1∶0 組銅綠微囊藻和斜生柵藻均難以生長(zhǎng),甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)率?;祓B(yǎng)銅綠微囊藻在12~14 d 期間的比生長(zhǎng)速率最大,后期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。N/P=2.5∶1 組兩種藻類的增長(zhǎng)率僅保持在0.3 左右,在第7 天出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),在第9 天其增長(zhǎng)率趨近于零。在前期階段,斜生柵藻增長(zhǎng)率要低于銅綠微囊藻,后期增長(zhǎng)率有所提高,說(shuō)明斜生柵藻受制于水體中磷含量,與高玉榮等[23]研究結(jié)論一致。在培養(yǎng)第10天,混養(yǎng)兩種藻類的比生長(zhǎng)率出現(xiàn)最大值。在培養(yǎng)22 d,純養(yǎng)或混養(yǎng)下兩種藻類的比生長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)。從第2 天開(kāi)始,N/P=5∶1 組兩種藻類的增長(zhǎng)率處在較為平穩(wěn)狀態(tài),從第6天開(kāi)始銅綠微囊藻的增長(zhǎng)率有所下降,而斜生柵藻在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均處在較低水平,可能與磷濃度的升高抑制其生長(zhǎng)有關(guān)。N/P=25∶1組銅綠微囊藻的增長(zhǎng)率一直保持在0.4左右,從第6天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),而在第9天其增長(zhǎng)率接近于零。在前期階段,斜生柵藻的增長(zhǎng)率要低于銅綠微囊藻,后期增長(zhǎng)率有所提高,說(shuō)明斜生柵藻適合在較低的磷濃度中生長(zhǎng)。在N/P=50∶1 組的接種初期,純養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)下的銅綠微囊藻和斜生柵藻均表現(xiàn)出較高的增長(zhǎng)率,但總體增長(zhǎng)率較低。從第6 天開(kāi)始,兩者增長(zhǎng)率明顯下降,第7 天后增長(zhǎng)率趨近于零,甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)??傮w上,混養(yǎng)培養(yǎng)下的斜生柵藻增長(zhǎng)受到銅綠微囊藻的影響,其增長(zhǎng)率低于純養(yǎng)模式。
圖4 不同氮磷比對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻比生長(zhǎng)速率的影響Fig.4 Effects of different N/P ratios on the specific growth rate of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus
不同氮磷比下銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖5,N/P=1∶0組,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,純養(yǎng)或混養(yǎng)兩種藻類的細(xì)胞密度均呈不同幅度的增長(zhǎng)趨勢(shì),但藻細(xì)胞數(shù)僅能維持在接種時(shí)的密度范圍內(nèi)。在培養(yǎng)第18 天,純養(yǎng)斜生柵藻的細(xì)胞密度最大,但隨后斜生柵藻逐漸死亡,細(xì)胞密度密度逐漸下降。在N/P=2.5∶1 組,在培養(yǎng)初期(2~6 d),兩種藻類的細(xì)胞密度增長(zhǎng)緩慢,從培養(yǎng)第8 天后,兩種藻類的細(xì)胞密度呈現(xiàn)出不同幅度的增長(zhǎng)趨勢(shì)。值得注意的是,純養(yǎng)銅綠微囊藻的細(xì)胞密度增幅最大,在培養(yǎng)第22天時(shí)其密度達(dá)到最大值??傮w上,無(wú)論是純養(yǎng)或混養(yǎng)銅綠微囊藻的細(xì)胞密度大于斜生柵藻,且混養(yǎng)斜生柵藻的細(xì)胞密度增幅較為平緩。在N/P=5∶1和N/P=25∶1組,兩種藻類的細(xì)胞密度增長(zhǎng)曲線一致。在培養(yǎng)6 d后,兩種藻類的細(xì)胞密度逐漸升高,以純養(yǎng)銅綠微囊藻的細(xì)胞密度增幅最大。在第20 天,純養(yǎng)斜生柵藻的細(xì)胞增幅出現(xiàn)最大值。在N/P=50∶1 組,從培養(yǎng)第14 天后,除純養(yǎng)斜生柵藻之外,純養(yǎng)和共養(yǎng)銅綠微囊藻、斜生柵藻的細(xì)胞密度增長(zhǎng)平緩。在培養(yǎng)第20天,純養(yǎng)斜生柵藻的細(xì)胞密度值最大??傮w上,在混養(yǎng)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的細(xì)胞密度均小于純養(yǎng),說(shuō)明兩種藻類之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。
圖5 不同氮磷比對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 Effects of different N/P ratios on the growth curve of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus
銅綠微囊藻和斜生柵藻的相對(duì)生長(zhǎng)速率如圖6所示,除N/P=1∶0組之外,自培養(yǎng)第8天始其他4組的KR值在1~2,說(shuō)明銅綠微囊藻具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)高氮磷比(N/P=25∶1和N/P=50∶1)下KR值趨近于1,說(shuō)明兩種藻類無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性。在培養(yǎng)16~18 d 期間,N/P=1∶0 組的KR值呈上升趨勢(shì),說(shuō)明此階段銅綠微囊藻表現(xiàn)出明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。培養(yǎng)第14天時(shí),在N/P=1∶0培養(yǎng)條件下,KR值低至-3.39,是由于斜生柵藻的生物量小于初始值,此時(shí)銅綠微囊藻仍具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。
圖6 銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻的相對(duì)生長(zhǎng)速率Fig.6 Relative growth ratio of Microcystis aeruginosa to Scenedesmus obliquus
研究顯示,氮和磷是影響藻類生長(zhǎng)的重要限制因素,且氮和磷的作用也是相互的[24]。代瑞華等[25]研究表明,在磷質(zhì)量濃度相同,不同氮磷比條件下,氮限制會(huì)對(duì)銅綠微囊藻生物量產(chǎn)生不利影響,在低氮濃度下銅綠微囊藻的生物量顯著降低。而本研究結(jié)果顯示,在氮質(zhì)量濃度相同,不同氮磷比的低磷濃度(N/P=50:1)下銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)均受到抑制。Chen 等[12]發(fā)現(xiàn)低濃度的氮、磷可以控制銅綠微囊藻的生長(zhǎng),且間接產(chǎn)生二甲胂酸此類毒物有關(guān)??仔赖萚11]研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度(氮磷分別為0.03,0.006 mg/L)下銅綠微囊藻的生長(zhǎng)速率最低,與本研究結(jié)論一致。當(dāng)N/P=25:1 和N/P=5:1 時(shí),兩種藻類均能正常生長(zhǎng)。但在N/P=2.5:1 時(shí),兩種藻類的生長(zhǎng)再次受到抑制。因此,氮、磷質(zhì)量濃度過(guò)高反而抑制兩種藻類的生長(zhǎng)。這是由于氮、磷質(zhì)量濃度具有一定的閾值范圍,兩者濃度過(guò)高使得藻密度達(dá)到飽和,導(dǎo)致其生長(zhǎng)速率降低。同時(shí),在高密度下藻類易產(chǎn)生有毒代謝物,不利于藻類生長(zhǎng)[26]。
此外,孔欣等[11]研究得出,氮磷比越高,銅綠微囊藻的生長(zhǎng)速度越快。孫凱峰等[27]研究得出,在氮、磷其中1 種豐富充足情況致使不同氮磷比的情況下,會(huì)改變銅綠微囊藻的生物量,使其成為優(yōu)勢(shì)種,降低了生物群落的多樣性。N/P=5:1 時(shí),銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。究其原因,是由于培養(yǎng)中的氮含量不能充分滿足藻類生長(zhǎng)繁殖的需求,因此銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到抑制。本研究選取的低濃度N/P=50:1下斜生柵藻所達(dá)到的峰值與磷適宜濃度達(dá)到的峰值差距較小,說(shuō)明斜生柵藻比微囊藻更適宜在低磷濃度條件下生長(zhǎng)。由此可見(jiàn),斜生柵藻生長(zhǎng)比銅綠微囊藻需要更多的氮源以維持細(xì)胞增殖,與許海等[17]結(jié)論一致。王敏等[28]研究發(fā)現(xiàn),氨氮濃度的降低使得藻占比逐漸下降,而藍(lán)藻逐漸成為優(yōu)勢(shì)種,也與本研究結(jié)論一致。研究發(fā)現(xiàn),斜生柵藻比銅綠微囊藻需要更多的氮源來(lái)維持細(xì)胞增殖[17]。從銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻的相對(duì)生長(zhǎng)速率KR值來(lái)看,本試驗(yàn)中除N/P=1:0 組之外,自培養(yǎng)第8 天始其他四組的KR值在1~2,說(shuō)明銅綠微囊藻具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。因此,高氮磷比有利于銅綠微囊藻生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)湖泊氮磷質(zhì)量比低于13[29-30],那么藍(lán)藻將會(huì)占優(yōu)勢(shì),高于這一比值,藍(lán)藻在整個(gè)藻類的生物量占比就會(huì)下降[30]。從本研究得出的KR值可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),高氮磷比(N/P=25:1 和N/P=50:1)下KR值趨近于1,說(shuō)明銅綠微囊藻生物量占比下降,其對(duì)斜生柵藻的抑制減弱。因此,在低磷濃度環(huán)境中易暴發(fā)斜生柵藻,而高磷濃度環(huán)境中更易暴發(fā)銅綠微囊藻,且兩種藻類的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)明顯,這與Smith[29]提出的理論基本一致。許海等[31]研究顯示當(dāng)湖泊水體中存在較高濃度的生物可利用磷時(shí),銅綠微囊藻具備獨(dú)特的生理生態(tài)特征,在藻類競(jìng)爭(zhēng)中具有優(yōu)勢(shì),且能保持較長(zhǎng)時(shí)間的指數(shù)增長(zhǎng)及生物量的增加,從而為水華創(chuàng)造有利條件。
(1)在氮磷濃度較低范圍內(nèi),隨著營(yíng)養(yǎng)鹽濃度增加會(huì)促進(jìn)銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長(zhǎng),但在高濃度范圍內(nèi),兩者生長(zhǎng)反而受營(yíng)養(yǎng)鹽濃度增加的限制。
(2)氮磷元素對(duì)銅綠微囊藻和斜生柵藻的生長(zhǎng)和競(jìng)爭(zhēng)均有顯著影響,兩種藻類在純養(yǎng)培養(yǎng)下的最大生物量顯著大于混養(yǎng)培養(yǎng),說(shuō)明混養(yǎng)培養(yǎng)下兩種藻類有競(jìng)爭(zhēng)性抑制。
(3)銅綠微囊藻對(duì)斜生柵藻具有較強(qiáng)的抑制性,尤其是在磷濃度較高的環(huán)境中其抑制性表現(xiàn)的更加強(qiáng)烈。
(4)除N/P=1:0 組之外,自培養(yǎng)第8 天始其他4 組的KR值在1~2,說(shuō)明銅綠微囊藻具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),高氮磷比(N/P=25:1和N/P=50:1)下KR值趨近于1。
江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2021年3期