張海波，李娟，黃勇，符芳翔，吳海芳

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院生殖科1、產(chǎn)科2，海南 ?？?570311

當(dāng)今社會(huì)男性不育群體越來(lái)越多，其中無(wú)精子癥占男性不育因素的15%～20%，在無(wú)精子癥中梗阻性無(wú)精子癥占40%[1-2]。但隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)、附睪精子冷凍技術(shù)、卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intra cytoplasmic sperm injection，ICSI)給梗阻性無(wú)精子癥(obstructive azoospermia，OA)患者獲得親血緣關(guān)系后代的機(jī)會(huì)。

OA患者在性激素正常及排除染色體性疾病的情況下進(jìn)行附睪或睪丸組織的診斷性穿刺檢查是否有精子，但多次穿刺睪丸或附睪可能存在不可逆的損傷，如患者想通過(guò)輔助生殖技術(shù)獲得后代，需用經(jīng)睪丸或附睪穿刺取得的新鮮精子行ICSI治療，但精子的獲能與成熟均在附睪中，OA患者穿刺部位首選附睪，如無(wú)精子再考慮穿刺睪丸部位[3]。本科一直使用PESA精子行ICSI治療，為了避免再次穿刺給患者帶來(lái)身體和心理的傷害及減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，男科醫(yī)生對(duì)附睪進(jìn)行診斷性穿刺檢查獲得活動(dòng)精子時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員采用附睪精子冷凍技術(shù)對(duì)診斷性穿刺獲得精子進(jìn)行冷凍保存，以便后續(xù)用于ICSI治療。但附睪精子經(jīng)過(guò)凍融后是否會(huì)有損傷，冷凍和新鮮的附睪精子治療OA患者取得的臨床結(jié)局差異如何有待進(jìn)一步研究，該問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。本研究旨在探討凍融PESA精子行ICSI治療對(duì)助孕結(jié)局的影響，以期更好的指導(dǎo)臨床工作，為患者提供更好的服務(wù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院生殖科2013年4月至2019年11月經(jīng)PESA取精行ICSI治療的161周期OA患者的臨床資料。根據(jù)是否凍融分為凍融PESA精子組(A組，55周期)和新鮮PESA精子組(B組，106周期)。無(wú)精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2013中華醫(yī)學(xué)會(huì)男性不育癥診療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)，即3次或3次以上精液離心后鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，同時(shí)排除不射精或逆行射精。

1.2 方法

1.2.1 附睪穿刺取精 患者取仰臥位，常規(guī)消毒后鋪巾，用0.9%氯化鈉注射液將2%利多卡因注射液稀釋成1%，并在同側(cè)精索局部麻醉下以拇指和食指固定附睪部位，將連接于5 mL注射器的頭皮針穿刺附睪頭部，在注射器保持適當(dāng)?shù)呢?fù)壓狀態(tài)下抽吸，直到有足夠量的乳白色或淡黃色的附睪液抽出，并置于含1 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，如果沒(méi)有液體抽出可改變穿刺方向抽吸，將抽吸出來(lái)的液體注入35 mL的小培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)室人員在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有足量的活動(dòng)精子，則終止手術(shù)。鏡檢未找到可用精子，則相同方法穿刺對(duì)側(cè)附睪。

1.2.2 附睪精子的冷凍保存和復(fù)蘇 (1)冷凍保存：將含有活動(dòng)精子的附睪懸液用微量梯度離心法離心，棄上清液留取沉淀物，加入2 mL 5%HTF溶液進(jìn)行洗滌，洗滌后棄上清留取0.3 mL精子懸液加入精子冷凍管，在冷凍管中緩慢加入0.3 mL精子冷凍保護(hù)劑充分混勻。將精子凍存管在室溫下靜置3 min，液氮蒸汽內(nèi)懸吊20 min后放入液氮罐中冷凍保存。(2)復(fù)蘇：從液氮罐中取出樣本，在室溫下10 min，完全融解后置于37℃培養(yǎng)箱40 min復(fù)溫，把復(fù)溫后的精液加入到2 mL培養(yǎng)液中洗滌，洗滌后留取0.3 mL精子懸液，在顯微鏡下觀察精子懸液是否有足量精子滿足ICSI需求。若足量則直接用做ICSI，不足量則需重新穿刺取精。

1.2.3 促排及采集卵母細(xì)胞行ICSI技術(shù) 按本科常規(guī)超促排方案進(jìn)行，然后監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育和血清激素情況，當(dāng)平均直徑≥18 mm的卵泡有1～2個(gè)時(shí)，或當(dāng)平均直徑≥17 mm的卵泡有3個(gè)及以上時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG)4 000～10 000 IU或艾澤250μg進(jìn)行扳機(jī)，36 h后經(jīng)陰道B超采集卵母細(xì)胞。胚胎學(xué)家拾到卵母細(xì)胞后培養(yǎng)2～3 h，進(jìn)行顆粒細(xì)胞的拆除，把成熟的卵母細(xì)胞用于ICSI。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)及移植 ICSI結(jié)束后把授精卵子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)觀察48～72 h。根據(jù)SART胚胎評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分，在符合移植條件的情況下選擇培養(yǎng)3 d后的1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，剩余可用胚胎進(jìn)行冷凍保存。移植胚胎第14天后抽取血清檢測(cè)β-HCG結(jié)果≥25 U/L或尿液HCG檢測(cè)陽(yáng)性即可確診為生化妊娠。胚胎移植第35天后，經(jīng)B超檢查發(fā)現(xiàn)孕囊及心管搏動(dòng)，即可確診為臨床妊娠。

1.3 觀察指標(biāo) ICSI正常受精率=2PN受精卵數(shù)/MII卵數(shù)×100%；正常卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN受精卵數(shù)×100%；可利用胚胎率=(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/2PN卵裂數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%；著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料不服從正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位間距M(P25，P75)進(jìn)行描述，做兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 A組和B組患者的男方年齡、女方年齡、獲卵個(gè)數(shù)、成熟MⅡ卵子個(gè)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的一般資料比較[M(P25，P75)]

2.2 兩組患者的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)比較 A組患者的正常受精率明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；但A組和B組患者的正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)比較(%)

2.3 兩組患者的臨床結(jié)局指標(biāo)比較 A組和B組的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組患者的臨床結(jié)局指標(biāo)比較(%)

3 討論

精子在附睪中逐步獲得了運(yùn)動(dòng)和受精能力，其中附睪管腔液微環(huán)境對(duì)精子的成熟和儲(chǔ)存起到十分重要的作用[4]。但在多種致病因素對(duì)附睪內(nèi)環(huán)境影響下，易導(dǎo)致精子的成熟障礙及雙側(cè)輸精管道梗阻，如射精管堵塞或先天性雙側(cè)輸精管梗阻導(dǎo)致精子無(wú)法通過(guò)陰道射出達(dá)到自然懷孕。在臨床上，對(duì)于以上患者的治療，傳統(tǒng)的首選治療方法是通過(guò)手術(shù)復(fù)通輸精管使其恢復(fù)輸精功能。輸精管復(fù)通手術(shù)失敗則可選擇附睪或睪丸進(jìn)行穿刺取精，借助輔助生殖技術(shù)ICSI進(jìn)行助孕。但是相對(duì)附睪穿刺，睪丸穿刺出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)高，且睪丸穿刺取得的精子成熟度相對(duì)欠佳或精子畸形率相對(duì)較高[5]，所以對(duì)于手術(shù)仍不能糾正的OA患者，首選取精方式為PESA。該方式的優(yōu)點(diǎn)是不需要切開(kāi)附睪、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)取精、患者術(shù)后恢復(fù)快[6-7]，以及隨著商品化精子冷凍保護(hù)劑的出現(xiàn)和精子冷凍技術(shù)的快速發(fā)展，精子與冷凍保護(hù)劑混懸液可以在-196℃液氮下保存?zhèn)溆??；颊呤状胃讲G穿刺檢查，如有精子則冷凍保存?zhèn)溆?，以免重?fù)穿刺患者的附睪，給患者帶來(lái)不可逆的身心傷害，為OA患者后續(xù)ICSI治療提供保障。研究表明附睪精子行ICSI可獲得與正常射精精子行ICSI相同的臨床結(jié)局[8-11]。目前，關(guān)于冷凍PESA精子和新鮮PESA精子行ICSI治療OA患者的臨床結(jié)局有無(wú)差異性，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性，雖然個(gè)別指標(biāo)會(huì)有差異性，但其最終臨床助孕結(jié)局都具有相似性。

葛斌等[12]通過(guò)分析該中心193個(gè)周期PESA精子行ICSI臨床結(jié)局比較發(fā)現(xiàn)冷凍組正常受精率、正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均略低于新鮮組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。余柯達(dá)等[13]研究結(jié)果表明冷凍組各項(xiàng)指標(biāo)均偏低于新鮮組，但臨床結(jié)局比較均無(wú)差異性，以上學(xué)者認(rèn)為精子在冷凍的過(guò)程中冰晶的形成對(duì)精子頂體膜的壓力增大出現(xiàn)頂體破壞，影響精子的受精能力或損傷精子的染色體。YU等[14]研究提示凍融組的正常受精率高于新鮮組，但是兩組間臨床結(jié)局比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。但大多數(shù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15-18]與本研究結(jié)論相似。本研究結(jié)果表明冷凍組的正常受精率顯著高于新鮮組，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組間的正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。雖然凍融組的受精率高于新鮮組，但是兩組間臨床結(jié)局相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常受精率與最終助孕臨床結(jié)局有無(wú)相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。造成本研究結(jié)果的原因可能是精子凍融過(guò)程本身就是自然篩選優(yōu)質(zhì)精子的過(guò)程，能耐受低溫保存的精子多數(shù)是頂體膜功能穩(wěn)定，代謝旺盛，活力強(qiáng)，DNA完整性好的優(yōu)質(zhì)精子。本研究顯示無(wú)論新鮮的附睪精子還是冷凍的附睪精子行ICSI受精發(fā)育成胚胎，其胚胎在體外培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)自我修復(fù)功能形成優(yōu)質(zhì)胚胎，移植后取得了相似的臨床結(jié)局。

綜上所述，隨著商品化精子冷凍保護(hù)劑和冷凍技術(shù)的成熟，降低了精子在凍融過(guò)程因溫度及滲透壓改變，冰晶形成，氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)精子頂體膜，線粒體膜，DNA完整性的損傷[19]。所以，對(duì)于OA患者的治療，凍融PESA精子行ICSI可獲得含自身遺傳物質(zhì)的后代，已經(jīng)得到了國(guó)內(nèi)外多家生殖中心的采納。但是還存在很多需要解決的問(wèn)題，如何降低凍融過(guò)程對(duì)精子的損傷及ICSI技術(shù)的操作對(duì)出生嬰兒遠(yuǎn)期的影響[20]，目前相關(guān)研究尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，需要長(zhǎng)期觀察。本研究的不足之處是國(guó)內(nèi)外各中心的研究樣本量均偏少，為非隨機(jī)對(duì)照研究。因此，關(guān)于冷凍PESA精子行ICSI對(duì)臨床結(jié)局的影響如何仍需大樣本多中心的臨床及基礎(chǔ)研究。本研究建議如果患者有冷凍保存的附睪精子，取卵日當(dāng)天首先使用凍存的附睪精子行ICSI，如解凍后無(wú)可用精子，再重新穿刺附睪使用新鮮精子。