高艷菊，申遼遼

榆林市第二醫(yī)院檢驗科，陜西 榆林 719000

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其主要病理類型為喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC)，占全世界所有惡性腫瘤的比例約為2%[1-2]。近年來，LSCC的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，但致病原因目前尚不明確。吲哚胺2，3-雙加氧酶1(Indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1)是催化色氨酸生成Kynurenine的限速酶，在色氨酸的代謝中起關鍵作用[3]。據(jù)報道，色氨酸的消耗和Kynurenine的積累可誘導效應T細胞凋亡和功能障礙，并產(chǎn)生免疫抑制調(diào)節(jié)性T細胞[4]。IDO1表達在人類食管癌[5]、卵巢癌[6]等多種類型的惡性腫瘤中升高，往往與不良預后有關。程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)最初在2000年被鑒定，是腫瘤微環(huán)境中致癌信號或動態(tài)干擾素γ表達的結果，被認為是一個免疫檢查點[7]。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關的PD-L1在體外和體內(nèi)可以增加T細胞凋亡，導致腫瘤細胞免疫逃逸，從而保護腫瘤細胞不被殺死[8]。目前，IDO1和PD-L1的表達與LSCC的相關報道較少。本研究通過免疫組化法檢測IDO1和PD-L1在LSCC組織中的表達情況，并分析IDO1和PD-L1表達與臨床病理特征及預后的關系，從而為LSCC的診療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2012年6月至2013年6月期間在榆林市第二醫(yī)院首次診斷為LSCC患者的臨床資料進行回顧性研究。納入標準：(1)均經(jīng)病理組織學確診為LSCC[9]；(2)均為初治患者，且已行手術治療；(3)臨床病理資料完整。排除標準：(1)曾接受過任何抗癌治療者(包括放療/誘導化療)；(2)既往/同步惡性腫瘤史者；(3)已知活動性炎癥性疾病(包括自身免疫性疾病和感染)或活動性肝或腎疾病。經(jīng)納入和排除標準篩選后，總共有85例LSCC患者納入本研究，其中男性83例，女性2例；年齡37～79歲，平均(63.1±4.3)歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年列出的頭頸部腫瘤組織病理學標準分類[10]：高分化35例，中分化31例，低分化19例；頸部淋巴結有轉移34例，無轉移者51例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期60例。術中取距離腫瘤至少0.5 cm以上且經(jīng)病理檢查確定為喉正常組織的28例標本為對照組[9]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組化染色 將石蠟切片在100℃檸檬酸三鈉緩沖液中加熱20 min，用于抗原修復。將切片與IDO1抗體和PD-L1抗體在室溫下孵育2 h。小鼠抗人IDO1單克隆抗體和小鼠抗人PD-L1單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。然后，將切片與二抗在室溫下孵育30 min。NBT/BCIP色劑顯色5 min，隨后使用蘇木素染色，脫水，清除，中性膠封，鏡下觀察。

1.3 結果判斷 光鏡下，細胞質背景清晰，陽性表達為棕黃色顆粒。本實驗觀察到的IDO1和PD-L1陽性染色主要定位于細胞質和細胞膜上。每個樣本隨機選取5個視野，計算每個視野中的陽性細胞的比例，取其平均值。陽性細胞的百分比分級標準：陽性細胞≤10%為陰性(-)，陽性細胞數(shù)≤30%為弱陽性(+)，陽性細胞數(shù)≤60%為陽性(++)，陽性細胞數(shù)＞60%為強陽性(+++)。統(tǒng)計時將(+)～(+++)均作為表達陽性。

1.4 隨訪 患者術后每隔3～6個月復查1次，根據(jù)復查結果診斷是否復發(fā)，必要時行手術確診。臨床醫(yī)師結合醫(yī)院門診復查病例資料及電話進行隨訪，隨訪至患者死亡或2019年9月30日。生存時間分別定義為從手術之日起至死亡之日或隨訪截止日期。

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關性檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LSCC組織與癌旁組織中IDO1和PD-L1的表達水平比較 IDO1和PD-L1陽性表達顯示為棕黃色或棕褐色著色，在LSCC組織中著色明顯(圖1、圖2)。IDO1和PD-L1在LSCC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中IDO1和PD-L1的表達水平比較

圖1 IDO1在LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中的陽性表達(×400)

圖2 PD-L1在LSCC患者腫瘤組織與癌旁組織中的陽性表達(×400)

2.2 IDO1表達與LSCC患者臨床病理特征的關系 IDO1陽性表達與LSCC患者TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關(P＜0.05)；而與患者的性別、年齡和腫瘤生長部位無關(P＞0.05)，見表2。

表2 IDO1表達與LSCC患者臨床病理特征的關系(例)

2.3 PD-L1表達與LSCC患者臨床病理特征的關系 PD-L1陽性表達與LSCC患者的TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關(P＜0.05)；而與患者的性別、年齡和腫瘤生長部位無關(P＞0.05)，見表3。

表3 PD-L1表達與LSCC患者臨床病理特征的關系(例)

2.4 IDO1和PD-L1在LSCC組織中表達的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，IDO1陽性表達和PD-L1陽性表達在LSCC腫瘤組織中呈正相關(r=0.527，P=0.021)，見圖3。

圖3 LSCC組織中IDO1和PD-L1陽性表達相關性圖

2.5 IDO1和PD-L1表達與LSCC患者預后的關系 按IDO1或PD-L1表達情況將85例LSCC患者分為高表達組和低表達組，其中47例IDO1陽性患者歸為高表達組，38例IDO1陰性患者歸為低表達組；53例PD-L1陽性患者歸為高表達組，32例PD-L1陰性患者歸為低表達組。通過Kaplan-Meier生存分析，分別繪制不同IDO1、PD-L1表達的LSCC患者的生存曲線。結果顯示，到隨訪截止時間，IDO1或PD-L1低表達組患者的平均總生存時間顯著長于高表達組患者(IDO1：45.5個月vs39.6個月；PD-L1：46.3個月vs38.8個月)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 LSCC患者不同IDO1、PD-L1表達組的生存曲線

3 討論

LSCC是喉癌中最常見的病理類型，占喉癌總數(shù)的90%以上[11]。現(xiàn)階段，LSCC的主要治療策略仍然是手術或全喉切除加放療的方式，盡管隨著科技手段的進步和生物臨床治療理論的更新，使得LSCC患者的生存率有所提高，但LSCC異質性高、侵襲性強，且發(fā)現(xiàn)時多處于晚期，治療手段有限，因此導致大多數(shù)的LSCC患者預后不良[12]。近年來免疫治療的興起為晚期惡性腫瘤患者的治療提供了可能，但是，“狡猾”的腫瘤細胞在其進化過程中選擇性轉錄某些基因，以抑制T細胞功能，使其喪失對腫瘤細胞的殺傷能力，從而實現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[13]。因此，研究并闡明腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸的分子機制對惡性腫瘤的治療極其重要。

IDO1是一種重要的先天免疫調(diào)節(jié)因子，其過度表達可能導致色氨酸耗竭和代謝產(chǎn)物的積聚，進而抑制效應T和NK細胞的分化和激活，為腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視提供條件[14]。此外，IDO1在感染、炎癥或細胞因子的作用下表達上調(diào)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)LSCC組織中IDO1陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，IDO1表達與LSCC患者TNM分期，淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關，且IDO1陽性表達與LSCC患者的預后不良顯著相關。在LSCC中，高表達的IDO1促進細胞中色氨酸的過度代謝，抑制效應T和NK細胞的分化和激活，導致LSCC的惡性進展。由此表明，IDO1可能是LSCC細胞中一個促進腫瘤進程，協(xié)助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)測的癌基因。IDO1陽性表達可作為評估LSCC患者預后不良的因子，IDO1可能成為判斷LSCC患者預后的輔助標志物。

PD-1是CD28家族的一個免疫抑制性輔助信號受體，可以在被激活的T細胞、B細胞等多種免疫細胞上發(fā)現(xiàn)它的存在[16]。PD-1的功能主要受其細胞質結構域的調(diào)控，包括基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)和基于免疫受體酪氨酸的開關基序(ITSM)，當PD-1識別其配體PD-L1時，這種相互作用誘導ITSM中酪氨酸殘基的磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶分子則被招募使下游的效應分子去磷酸化，發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，從而抑制T細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生[17]。PD-1下調(diào)T細胞活性，影響負性免疫應答，當腫瘤微環(huán)境中PD-1與PD-L1結合時，T細胞功能減弱，致使抗腫瘤反應結果受到強烈抑制，并有利于腫瘤逃避。研究發(fā)現(xiàn)，與雌激素受體陽性的乳腺癌相比，在三陰性乳腺癌中顯示出更高水平的PD-L1表達[18]。同樣的，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，PD-L1的高表達幫助肺癌腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)測，促進其生長和轉移[19]。本研究顯示LSCC組織中PD-L1的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，PD-L1表達與LSCC瘤患者的TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤分化程度相關，且PD-L1的陽性表達與LSCC患者的預后不良顯著相關。這些結果表明，在LSCC微環(huán)境中，PD-L1/PD-1信號通路可能通過抑制T細胞活性，協(xié)助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)測，從而促進LSCC腫瘤細胞的生存發(fā)展。通過Pearson相關性分析顯示，在LSCC腫瘤組織中，IDO1陽性表達和PD-L1陽性表達呈正相關。

綜上所述，IDO1和PD-L1在LSCC患者癌組織中陽性表達率升高，可能協(xié)同參與LSCC的免疫逃逸，與LSCC惡性行為有關，且IDO1和PD-L1陽性表達患者預后不良，有可能作為LSCC患者診療靶標和預后輔助標志物。但本研究仍然存在著一些不足之處：(1)單一中心的樣本數(shù)量較少，研究結果可能存在一定的偏差。(2)LSCC腫瘤組織的標本存放時間存在差異，可能導致組織中IDO1和PD-L1的免疫組化檢測結果存在偏差，影響結果的統(tǒng)計分析。今后將進一步完善研究方法和策略，以期獲取更加全面準確的數(shù)據(jù)和結論。