俞靈盈，王國兵，，溫鵬強(qiáng)，梅潔花，齊中香，徐明國，劉琮，李成榮

1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；

2.深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所，廣東 深圳 518038；

3.深圳市兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518038

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種常見的嬰幼兒急性全身性中、小血管炎綜合征，可導(dǎo)致嚴(yán)重的冠狀動脈損傷或冠狀動脈瘤，其病因及發(fā)病機(jī)制迄今仍不完全清楚。大量的臨床研究及流行病學(xué)調(diào)查表明KD可能是感染引起的急性自身免疫性血管炎綜合征，但導(dǎo)致自身免疫耐受異常的原因尚不清楚[1-4]。除過度的系統(tǒng)性炎癥外，KD患兒還存在B細(xì)胞異常活化、自身抗體反應(yīng)、漿細(xì)胞多器官浸潤、外周血免疫復(fù)合物異常增高等臨床表現(xiàn)，提示體液免疫異?？赡茉贙D的免疫發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[1，5-7]。α-干擾素(interferonα，IFN-α)通過下游信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 1，STAT3)信號誘導(dǎo)未成熟B細(xì)胞分化為漿母細(xì)胞(plasmablast，PB)和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell，Breg)，前者最終轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并介導(dǎo)抗體生成及體液免疫反應(yīng)，后者負(fù)反饋抑制IFN-α信號及PB細(xì)胞分化，從而維持機(jī)體免疫動態(tài)平衡[8-12]。本文觀察IFN-α/STAT1/STAT3信號改變對KD患兒PB/Breg細(xì)胞分化失衡的影響，旨在進(jìn)一步探討KD的免疫發(fā)病機(jī)制，為KD的臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2020年10月深圳市兒童醫(yī)院診治的KD患兒38例，其中男性23例，女性15例；年齡1.2～5.1歲，中位年齡2.68(2.17，3.59)歲；病程均在10 d以內(nèi)。診斷按日本川崎病研究會制定的標(biāo)準(zhǔn)：(1)持續(xù)發(fā)熱(39℃～40℃)≥5 d；(2)手指或足指趾端硬性腫脹，第2～4周手腳掌、指趾尖或肛周可出現(xiàn)膜狀脫屑；(3)全身多形性充血皮疹，無水泡及結(jié)痂；(4)雙側(cè)眼結(jié)膜彌漫性充血，一般無分泌物；(5)口唇或口腔黏膜變化，如草莓舌、口咽黏膜充血，嘴唇紅腫、皸裂或流血；(6)頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大，單側(cè)或雙側(cè)，直徑≥1.5 cm。(1)+(2)～(6)項中符合≥4項，且能排除其他可以造成類似癥狀的疾病，可確診為川崎病。所有KD患兒均行動態(tài)心臟彩色多普勒檢查，其中KD合并冠狀動脈損傷的診斷指標(biāo)為：(1)冠狀動脈擴(kuò)張：＜3歲冠狀動脈內(nèi)徑＞2.5 mm，3～5歲冠狀動脈內(nèi)徑＞3.0 mm，≥5歲冠狀動脈內(nèi)徑＞4.0 mm；(2)冠狀動脈瘤：①冠狀動脈內(nèi)徑4.0～8.0 mm；＞5歲冠狀動脈擴(kuò)張的內(nèi)徑為正常的1.5～4倍；②巨大冠狀動脈瘤：冠狀動脈內(nèi)徑＞8.0 mm；＞5歲冠狀動脈擴(kuò)張的內(nèi)徑＞正常4倍。根據(jù)是否合并冠狀動脈損傷將KD患兒分為冠狀動脈損傷組(CAL組，16例)和無冠狀動脈損傷組(NCAL組，22例)。所有患兒分別于急性期(KD組)及IVIG治療有效后4～5 d(KDIVIG組)取血備檢。同期健康兒童28例為對照組(Ctrl組)，其中男性16例，女性12例；年齡1.5～5.6歲，中位年齡2.64(1.99，3.83)歲。Ctrl組、KD組和KDIVIG組、CAL組和NCAL組患兒年齡和性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。所有血樣均立即送檢。受試者家屬對實驗均已知情并簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并獲得批準(zhǔn)(JCYJ20180228175700233)。

1.2 外周血PB、Breg細(xì)胞比例及相關(guān)信號蛋白檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測：①經(jīng)CD19-APC-Cy7、CD24-eFluor450、CD38-PerCP-Cy5.5、CD40-PE表面染色，破除紅細(xì)胞后，洗滌并上機(jī)檢測外周血CD19+CD24+CD38hi(Breg)、CD19+CD24-CD38hi(PB)細(xì)胞比例及CD19+B細(xì)胞表面細(xì)胞分化抗原(CD40)蛋白表達(dá)水平；②經(jīng)CD19-APC-Cy7表面染色，破除紅細(xì)胞后，固定、破膜，加入磷酸化的STAT1(pSTAT1)-PE、磷酸化的STAT3(pSTAT3)-Alexa Fluor647抗體孵育30 min，洗滌并上機(jī)檢測外周血B細(xì)胞pSTAT1、pSTAT3蛋白表達(dá)水平；③取1 mL抗凝外周血，經(jīng)密度梯度離心法分離PBMC，按1×106/mL重懸于含1μg/mL Ionomycin、300 ng/mL PMA、2μmol/L Monensin和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃下刺激培養(yǎng)6 h，收獲細(xì)胞。經(jīng)CD19-APC-Cy7、CD24-eFluor450、CD38-PerCP-Cy5.5表面染色后，固定、破膜，加入白細(xì)胞介素6(IL-6)-PE-Cy7、白細(xì)胞介素10(IL-10)-PE、腫瘤壞死因子α(TNF-α)-APC抗體孵育30 min，洗滌并上機(jī)檢測Breg細(xì)胞IL-10及B細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平。所有流式結(jié)果采用FlowJo Ver 10.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中蛋白表達(dá)水平采用平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

1.3 PB、Breg細(xì)胞分化相關(guān)分子mRNA水平檢測 采用實時熒光定量PCR法：①取500μL抗凝外周靜脈血，與免疫磁珠(美國Life公司，113.31D)混勻孵育并分離CD19+B細(xì)胞，經(jīng)裂解、過柱、洗脫后純化總RNA；②根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(美國Life公司，K1632)步驟，以總RNA為模板，合成cDNA；③根據(jù)B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1(Blimp-1)、干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF-4)、α/β-干擾素受體亞基1(IFNAR1)、α/β-干擾素受體亞基2(IFNAR2)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)及β-肌動蛋白(β-actin)mRNA序列，經(jīng)Oligo 7.0軟件設(shè)計、合成引物(表1)；采用實時熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物，RR82LR)進(jìn)行相對定量分析，結(jié)果以待測基因mRNA拷貝數(shù)與β-actin mRNA拷貝數(shù)的比值表示。

1.4 血漿IFN-α蛋白水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：①取部分抗凝外周血，室溫下靜置30 min后，500×g離心15 min，分離上層血漿；②參照ELISA試劑盒(美國Thermal Fisher，BMS216)步驟說明，經(jīng)酶標(biāo)儀(美國Thermal Fisher，Synergy H1)檢測標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品孔吸光度；③采用Gen5軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸公式后，計算待測樣品IFN-α蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗后，再進(jìn)行組間多重比較。KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達(dá)的關(guān)系予以Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PB/Breg細(xì)胞亞群及轉(zhuǎn)錄因子、功能相關(guān)因子檢測結(jié)果 與Ctrl組相比，KD組PB細(xì)胞亞群比例及轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1、IRF-4表達(dá)顯著升高，Breg細(xì)胞亞群比例及IL-10表達(dá)明顯降低，其中CAL亞組前三項指標(biāo)高于NCAL亞組，后二項指標(biāo)低于NCAL亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)IVIG治療后，KDIVIG組PB細(xì)胞亞群比例及轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1、IRF-4表達(dá)明顯低于KD組，Breg細(xì)胞比例及IL-10表達(dá)高于KD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 PB/Breg細(xì)胞亞分化調(diào)節(jié)信號相關(guān)分子檢測結(jié)果 急性期KD組血漿IFN-α蛋白濃度、CD19+B細(xì)胞表面受體CD40、IFNAR1、IFNAR2及下游信號相關(guān)分子pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達(dá)水平明顯高于Ctrl組，pSTAT3表達(dá)水平低于Ctrl組，其中CAL亞組前八項指標(biāo)高于NCAL亞組、pSTAT3表達(dá)水平低于NCAL亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)IVIG治療后，KDIVIG組血漿IFN-α蛋白濃度及CD19+B細(xì)胞CD40、IFNAR1、IFNAR2、pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達(dá)水平低于KD組，pSTAT3表達(dá)水平高于KD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 KD患兒PB、Breg細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號相關(guān)分子檢測結(jié)果比較[M(P25，P75)]

2.3 IFN-α信號負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1/SOCS3表達(dá)檢測結(jié)果 與Ctrl組相比，KD組外周血B細(xì)胞SOCS1、SOCS3表達(dá)水平顯著增高，其中CAL亞組SOCS3表達(dá)高于NCAL亞組、SOCS1表達(dá)低于NCAL亞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)IVIG治療后，KDIVIG組SOCS1、SOCS3表達(dá)水平明顯低于KD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

2.4 SOCS與STAT表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=0.67、0.52，P＜0.05)。

注：與Ctrl組比較，a P＜0.05；與NCAL亞組比較，b P＜0.05；與KD組比較，c P＜0.05。

注：與Ctrl組比較，a P＜0.05；與NCAL亞組比較，b P＜0.05；與KD組比較，c P＜0.05。

3 討論

KD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其發(fā)生及病理損傷可能與感染引發(fā)的自身免疫功能過度活化有關(guān)，但導(dǎo)致自身免疫耐受異常的機(jī)制尚未完全闡明[1-4]。除系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)外，KD患兒還存在B細(xì)胞多克隆活化、IgA+漿細(xì)胞異常增多且呈全身多器官浸潤、外周血免疫復(fù)合物及抗自身抗體水平異常增高等現(xiàn)象[1，5-7]，提示KD的發(fā)病機(jī)制可能與B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫有關(guān)，但導(dǎo)致B細(xì)胞異?；罨姆肿訖C(jī)制及介導(dǎo)途徑目前仍不清楚。PB細(xì)胞和Breg細(xì)胞是一對具有免疫活性作用的B細(xì)胞亞群，前者在內(nèi)、外環(huán)境的刺激下最終分化為漿細(xì)胞并通過產(chǎn)生抗體而介導(dǎo)體液免疫，后者分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而維持體內(nèi)免疫反應(yīng)動態(tài)平衡[10-12]。本研究注意到KD組PB細(xì)胞亞群比例及轉(zhuǎn)錄因子Blimp-1、IRF-4表達(dá)明顯高于健康對照組，Breg細(xì)胞亞群比例及IL-10表達(dá)低于健康對照組，其中CAL亞組前三項指標(biāo)高于NCAL亞組、后兩項指標(biāo)低于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療后明顯恢復(fù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果與國外的報道相一致[13-14]，提示KD患兒免疫發(fā)病機(jī)制可能與PB細(xì)胞過度活化、Breg細(xì)胞數(shù)量及功能低下有關(guān)。但導(dǎo)致急性期KD患兒PB/Breg細(xì)胞失衡的調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍不清楚。

未成熟B細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)可分化為PB細(xì)胞和Breg細(xì)胞，因細(xì)胞因子濃度不同兩者間可相互轉(zhuǎn)化，其中IFN-α/STAT1/STAT3信號在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[8-10，15]。在共刺激分子CD40被激活的條件下，IFN-α與未成熟B細(xì)胞表面受體IFNAR結(jié)合，進(jìn)而激活酪氨酸激酶JAK1(janus kinase 1，JAK1)/STAT1/STAT3信號?；罨腏AK磷酸化STAT1和STAT3，其中磷酸化的pSTAT1啟動炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)并促使未成熟B細(xì)胞分化為PB細(xì)胞，而pSTAT3誘導(dǎo)抑制性的細(xì)胞因子IL-10及Breg細(xì)胞產(chǎn)生，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡[8-9]。為探討IFN-α/STAT1/STAT3信號對PB/Breg細(xì)胞失衡的影響，本研究發(fā)現(xiàn)KD組血漿IFN-α蛋白濃度、B細(xì)胞表面受體CD40、IFNAR1、IFNAR2及下游信號分子pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達(dá)水平明顯高于健康對照組，pSTAT3表達(dá)水平低于健康對照組，其中CAL亞組前述8項指標(biāo)高于NCAL亞組、后一項指標(biāo)低于NCAL亞組，經(jīng)IVIG治療后呈不同程度恢復(fù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示IFN-α下游信號分子pSTAT1、pSTAT3表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致急性期KD患兒PB/Breg細(xì)胞失衡的重要原因。上述結(jié)果與MENON等[9]在系統(tǒng)性紅班狼瘡患者中的研究發(fā)現(xiàn)較為類似，但目前尚未見有川崎病相關(guān)的研究報道。

活化的STAT可啟動負(fù)性調(diào)節(jié)分子SOCS的表達(dá)，其中SOCS1抑制STAT1、STAT3的活化，而SOCS3則特異性抑制STAT3的活化，進(jìn)而形成負(fù)反饋抑制效應(yīng)維持機(jī)體免疫動態(tài)平衡[16-18]。但目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)于KD患兒B細(xì)胞SOCS和STAT之間相互調(diào)節(jié)的研究或報道。為進(jìn)一步探討導(dǎo)致pSTAT1、pSTAT3表達(dá)異常的分子機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)KD組外周血B細(xì)胞SOCS1、SOCS3表達(dá)水平明顯高于健康對照組，其中CAL亞組SOCS1表達(dá)低于NCAL亞組、SOCS3表達(dá)高于NCAL亞組，而IVIG治療后的KDIVIG組SOCS1、SOCS3表達(dá)水平明顯低于KD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，Pearson相關(guān)分析顯示KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達(dá)之間均呈負(fù)相關(guān)，提示急性期KD患兒pSTAT1、pSTAT3表達(dá)異?？赡芘c負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1表達(dá)相對不足及SOCS3過度活化有關(guān)。

綜合上述結(jié)果，推測感染觸發(fā)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致急性期KD患兒炎癥細(xì)胞因子(如IFN-α等)大量產(chǎn)生。IFN-α與未成熟B細(xì)胞表面受體結(jié)合并激活下游JAK/STAT信號，其中負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS1表達(dá)相對不足導(dǎo)致pSTAT1過度活化，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生并促使未成熟B細(xì)胞分化成PB細(xì)胞，而SOCS3過表達(dá)則通過抑制pSTAT3阻礙了Breg細(xì)胞的分化，最終導(dǎo)致PB/Breg細(xì)胞失衡并推動機(jī)體炎癥及體液免疫反應(yīng)的發(fā)展。但這一結(jié)論尚需后續(xù)大樣本的臨床觀察及動物實驗加以證實。此外，PB/Breg細(xì)胞的分化受細(xì)胞因子信號、表觀遺傳學(xué)等多種機(jī)制調(diào)控，是否存在其他因素參與調(diào)節(jié)KD患兒PB/Breg細(xì)胞動態(tài)平衡仍有待進(jìn)一步研究。