譚斌，全旭，李博*

（1. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2. 南京圣和藥業(yè)研發(fā)中心，江蘇 南京 210018）

Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）蛋白是一個重要的信號傳感器，通過與鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine triphosphate，GTP）或鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合，在活化和失活2種狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，以此來控制細(xì)胞信號傳導(dǎo)。KRAS蛋白發(fā)生某些突變后，其內(nèi)在的GTP酶（GTPase）活性喪失，因此被鎖定在與GTP結(jié)合的狀態(tài)即活化狀態(tài)，從而持續(xù)激活下游信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于KRAS基因突變率高且易誘導(dǎo)腫瘤耐藥，因此抑制KRAS信號通路被認(rèn)為可能是腫瘤治療的有效策略之一。

1 KRAS簡介

大鼠肉瘤病毒同源癌基因（rat sarcoma viral oncogene homolog，Ras）廣泛存在于各種真核生物如哺乳動物、果蠅、真菌及線蟲中，能夠參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡等生命活動[1]。人類的RAS基因編碼3種高度同源的RAS蛋白：HRAS、NRAS和KRAS[2-3]。KRAS基因位于人類12號染色體上，長約35 kb，含有4個編碼外顯子和1個5′端非編碼外顯子，其第4個外顯子有2種變異體，可編碼KRAS4A和KRAS4B2種剪接體[4-5]。

1.1 KRAS蛋白結(jié)構(gòu)

KRAS是一種原癌基因，由其編碼188 ～ 189個氨基酸組成KRAS蛋白，KRAS蛋白的相對分子質(zhì)量約為21 000[6]。KRAS蛋白含有4個結(jié)構(gòu)域，其中N端的第1個結(jié)構(gòu)域為85個氨基酸殘基組成的高度保守序列，第2個結(jié)構(gòu)域為相似性相對較低的序列，2個結(jié)構(gòu)域共同形成對KRAS信號傳導(dǎo)非常重要的G結(jié)構(gòu)域[7]。G結(jié)構(gòu)域含有GTP結(jié)合口袋，該口袋對于下游效應(yīng)分子與GTP酶活化蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）之間的相互作用是必需的。KRAS蛋白的C端含有高變結(jié)構(gòu)區(qū)，該結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)蛋白生物活性方面起重要作用[8]。

1.2 KRAS蛋白功能

KRAS蛋白是一類GTP結(jié)合蛋白，通過與GTP和GDP的結(jié)合來調(diào)控自身活性（見圖1）。生理條件下，2種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換受到鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和GTP 酶激活蛋白的調(diào)節(jié)[8-9]。GEFs協(xié)助GTP 取代GDP結(jié)合并活化KRAS蛋白，活化的KRAS蛋白進而激活下游信號通路并將信號傳遞至下游效應(yīng)器。當(dāng)KRAS-GTP進一步與GAPs結(jié)合后，KRAS蛋白內(nèi)在的GTP酶活性得到增強，將GTP水解成GDP，KRAS蛋白因而失活[10-11]。因此，KRAS蛋白通過與GTP或GDP結(jié)合，在活化和失活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)下游信號通路的開啟和關(guān)閉，從而完成信號傳導(dǎo)。

2 KRAS介導(dǎo)的信號通路

KRAS作為一種信號傳感器，可將上游信號分子的刺激信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、存活和凋亡等生命活動[12]。KRAS蛋白可被生長因子、趨化因子、Ca2+或酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）激活，活化的KRAS蛋白可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激 酶B（protein kinase B，AKT）-雷帕霉素靶蛋 白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Ras-快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf）-分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、鳥嘌呤核苷酸解離刺激因子（ral guanine nucleotide dissociation stimulator，RalGDS）- Ras樣蛋白（ras-like protein，Ral）及 Ras同源蛋白（ras homologue，Rho）/Ras相關(guān)C3肉毒素底物（rasrelated C3 botulinum toxin，Rac）等信號通路[13]。

2.1 PI3K-AKT-mTOR通路

PI3K-AKT-mTOR信號通路被認(rèn)為在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等細(xì)胞生命活動中具有重要作用，同時對腫瘤耐藥性的產(chǎn)生也具有較大影響[14-15]。KRAS蛋白與膜受體結(jié)合激活PI3K的p85亞基，再與p110亞基結(jié)合使PI3K活化，激活的PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)化成第二信使三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3）[16]。PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（phosphoinositide dependent kinase 1，PDK1）結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的蘇氨酸磷酸化位點（Thr308），mTOR復(fù)合物2（mTOR complex 2，mTORC2）進一步磷酸化AKT蛋白的絲氨酸磷酸化位點（Ser473），從而使AKT蛋白完全活化[17-18]。

活化的AKT進入細(xì)胞核，激活或抑制下游多種效應(yīng)因子，進而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡及代謝等過程[19]。一方面，AKT可直接激活mTOR靶蛋白。mTOR具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、代謝及蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄中起著重要作用[20]。mTOR由mTORC1和mTORC2組成，共同發(fā)揮作用[21]。其中，mTORC1被AKT激活，進而磷酸化真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E結(jié)合蛋白-1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP-1）和p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）[22]。磷 酸 化的翻譯抑制因子4EBP-1能夠促進腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)蛋白的表達，包括細(xì)胞周期蛋白1（cyclin D1）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[23-24]，p70S6K則可磷酸化并激活核糖體40S小亞基S6蛋白，進而促進胰島素受體底物-1（insulin receptor substract-1，IRS-1）的表達，從而導(dǎo)致胰島素抵抗[25]。mTORC2能夠阻止蛋白質(zhì)磷酸酶2A（protein phosphatae 2A，PP2A）的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）與PP2A的結(jié)合，促使PP2A對原癌基因c-Myc的去磷酸化而使其降解，從而降低促凋亡miRNA的轉(zhuǎn)錄及其對E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）的表達抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡[26]。另一方面，AKT還可以磷酸化并激活Bcl- xl /Bcl-2相關(guān)死亡啟動子（Bcl-xL/Bcl-2-associated death promoter，BAD），活化的BAD進而與伴侶蛋白14-3-3結(jié)合， 使BAD蛋白去磷酸化以及與Bcl-2/Bcl-xl的結(jié)合受到抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡[27-28]。

2.2 Ras-Raf-MEK-ERK信號通路

Ras-Raf-MEK-ERK信號通路是一條有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，能將細(xì)胞外信號傳遞入細(xì)胞核內(nèi)，從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、免疫應(yīng)答及轉(zhuǎn)錄等生命活動[29-30]。

KRAS蛋白結(jié)合并活化其膜受體，使之與生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，Grb2）和SOS （son of sevenless）蛋 白結(jié)合，形成受體-Grb2-SOS三元復(fù)合物。該復(fù)合物的SOS與其受體或受體底物的酪氨酸磷酸化位點結(jié)合后，再與KRAS-GDP結(jié)合，促使GTP取代GDP而激活KRAS[31]，形成的KRAS-GTP將胞漿中的Raf蛋白募集到質(zhì)膜上，并誘導(dǎo)Raf構(gòu)象改變，促進 Raf同源或異源二聚化而激活[32]。Raf的C端催化域與雙特異性激酶 —— MEK1/2結(jié)合，并使之磷酸化而活化。MEK1/2進而磷酸化并激活ERK1/2，活化的ERK可以磷酸化p90核糖體S6激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）、血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）、E26轉(zhuǎn)錄因子（E26 transformationspecific transcription factors，ETS）及Elk-1轉(zhuǎn)錄因子（ETS like-1 protein）等來調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及遷移等生命活動[33-35]。

2.3 RalGDS-Ral通路

RalGDS是一種GTP/GDP交換因子，能促進Ral蛋白的GDP/GTP轉(zhuǎn)換，RalGDS是Ras的下游信號蛋白，能夠通過與Ras的活性形式結(jié)合而發(fā)揮作用[36]。首先，活性形式的Ras-GTP通過與RalGDS的Ras/Rap結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ras/Rap binding domain，RBD）結(jié)合將其遞送至質(zhì)膜上與Ral結(jié)合，從而使Ral活化[37]。Ral蛋白的下游效應(yīng)因子包括Rac/細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）、TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）和動力蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）等[38]。其中，Rac/Cdc42屬于Rho家族GTP酶，其被認(rèn)為與細(xì)胞的遷移運動有關(guān)，因此KRAS突變蛋白通過下游信號通路激活Rac/Cdc42能夠促進腫瘤細(xì)胞的遷移[38]。TBK1不僅能夠介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生和抗病毒先天免疫，也能夠介導(dǎo)KRAS依賴性腫瘤細(xì)胞的生存和增殖[39]。Drp1不僅是線粒體和過氧化物酶體裂變所必需的，而且能夠促進KRAS驅(qū)動的糖酵解通量，從而促進腫瘤生長[40-41]。

2.4 Rho/Rac通路

Rho小G蛋白家族屬于Ras超家族，是一類具有GTP酶活性的核苷酸依賴型的GTP結(jié)合蛋白，包 括 有Rho、Rac、Cdc42、Rnd、RhoD及TTF等亞家族成員，Rho小G蛋白通過與GDP和GTP結(jié)合在活化和失活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，這2種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換由GEFs、GAPs和鳥苷酸解離抑制劑（guanine nucleotide dissociation inhibitors，GDIs）3種 蛋 白共同調(diào)節(jié)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、骨架形成及細(xì)胞周期等生命活動[42-43]。GEFs和GAPs對Rho小G蛋白的調(diào)節(jié)作用與KRAS蛋白一樣，而GDIs能夠通過抑制核苷酸的解離來干擾Rho家族蛋白與GDP和GTP結(jié)合[44]?；罨腞ho蛋白能夠激活Rho相關(guān) 激 酶（Rho-associated kinase，ROCK）和 威 奧綜合征蛋 白（Wiscott-Aldrich syndrome protein，WASP）。其中，ROCK具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，能夠介導(dǎo)細(xì)胞死亡[45]。WASP 通過與WASP相互作用蛋白（WASP-interacting-protein，WIP）相互作用調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）的信號傳導(dǎo)，從而抑制T細(xì)胞淋巴瘤生長[46]。

3 KRAS基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展

3.1 KRAS基因突變

Ras基因是人類癌癥中首個被鑒定出來的致癌基因[46]，該家族基因突變約占所有腫瘤相關(guān)突變的20% ～ 30%，與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[47]。KRAS基因突變約占Ras基因家族突變的85%，并比Ras家族其他基因突變更易促進腫瘤的發(fā)生[48]。遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究表明，在Ras突變中，KRAS突變頻率顯著高于HRAS和NRAS突變[49]。點突變是最常見的KRAS基因突變方式，一般發(fā)生在2號外顯子第12、13位甘氨酸密碼子及3號外顯子第61位谷氨酰胺密碼子上，尤以第12位密碼子突變最為常見[50]，已發(fā)現(xiàn)的12位甘氨酸（G）點突變包括G12A、G12D、G12V及G12C等，其中G12D突變頻率遠(yuǎn)高于其他G12突變[51]。

3.2 KRAS基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展

KRAS基因發(fā)生突變后，其編碼表達的KRAS蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，使KRAS蛋白幾乎完全喪失內(nèi)在的GTPase酶活性，GTP從KRAS上解離減少，GDP與KRAS結(jié)合能力減弱，從而使KRAS蛋白一直處于活化狀態(tài)，持續(xù)激活下游信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)紊亂，造成細(xì)胞不可控制地增殖惡變，進而促進腫瘤的發(fā)生[52]。

3.2.1 胰腺癌 胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[53]，KRAS突變是胰腺癌患者中最常見的突變類型，超過90%的胰腺癌患者存在KRAS突變，說明KRAS基因突變對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響[54-55]。

Cheng等[56]研究發(fā)現(xiàn)，KRASG12D突變與胰腺癌組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）高比例浸潤密切相關(guān)，KRASG12D突變通過激活下游的MEK/ERK通路，促進ERK磷酸化，造成白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的過表達，使得 Tregs大量富集，最終導(dǎo)致胰腺癌組織產(chǎn)生免疫抑制。Wang等[57]通過KRAS基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)，利用shRNA敲除KRAS導(dǎo)致人胰腺癌細(xì)胞中的白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）mRNA的表達下降，且發(fā)現(xiàn)抑制KRAS下游蛋白MEK能夠下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞中LIF的表達，而過表達的LIF能夠以反饋機制介導(dǎo)KRAS驅(qū)動腫瘤的癌變。Liou等[58]發(fā)現(xiàn)KRASG12D突變可誘導(dǎo)產(chǎn)生線粒體氧化應(yīng)激，引發(fā)胰腺腺泡細(xì)胞的去分化，并激活蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路而上調(diào)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達，導(dǎo)致驅(qū)動胰腺癌癌前病變的形成，并且PKD1作為PI3K/Akt通路的重要信號蛋白，其異?；罨瘯绊慉kt的完全活化，從而影響Akt下游蛋白的表達。此外，Liang等[59]發(fā)現(xiàn)腺苷二磷酸核糖基化因子6（adenosine diphosphate ribosylation factor 6，ARF6）是KRAS的下游信號蛋白，KRAS突變能通過MEK信號通路傳導(dǎo)激活A(yù)RF6。ARF6除能夠以反饋機制維持KRAS介導(dǎo)的ERK激活外，還能夠增強胰腺癌侵襲組織和逃避免疫系統(tǒng)的能力[60]?？梢?，KRAS突變能夠通過信號通路傳導(dǎo)激活多種下游信號蛋白來促進胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥等。

3.2.2 結(jié)直腸癌 結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤，其中轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的5年生存率不足12%，約有40%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者伴有Ras基因突變，而其中最主要突變是KRAS突變[61-63]。

KRAS基因突變后，激活下游Ras-Raf-MEKERK信號通路，進而破壞樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的募集功能和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）的分子呈遞能力，從而誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞癌變[64-65]。Brandt等[66]研究揭示，KRASG12V突變能夠細(xì)胞特異性地活化ERK激酶，且ERK活化同時受到細(xì)胞特異性的MEK/ERK信號通路調(diào)節(jié)，導(dǎo)致ERK激酶高度活化。此外，KRAS突變蛋白可協(xié)同β-連環(huán)蛋白利用高度活化的ERK激酶促進小腸隱窩細(xì)胞擴增。Pierroa等[67]研究發(fā)現(xiàn)，KRASG13D突變通過重構(gòu)ERK通路依賴的基質(zhì)相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）的表達來影響ERK通路介導(dǎo)下游信號分子的表達，從而抑制鈣池操縱的Ca2+流入（store-operated Ca2+entry，SOCE）和鈣釋放激活鈣離子（Ca2+release-activated current，CRAC）通道，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放減少，最終促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。Chu等[68]研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變體（KRASG13D和KRASG12V）能夠通過激活MEK-ERKs介導(dǎo)的信號通路上調(diào)Y-box結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein 1，YB-1）的表達，進而激活胰島素樣生長因子-1受體（insulin-like growth factor-I receptor，IGF-IR)蛋白的表達，從而促進結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。Toda等[69]研究發(fā)現(xiàn)，KRASG13D突變激活腫瘤細(xì)胞中PI3K-Akt-mTOR信號通路，誘導(dǎo)天冬酰胺合成酶（ASNS）的過表達，導(dǎo)致天冬氨酸水平顯著降低和天冬酰胺的含量水平上升，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)在缺乏營養(yǎng)條件下生長。隋華等[70]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是PI3K/Akt信號通路的下游蛋白，KRAS突變后，PI3K/Akt通路被激活，磷酸化增加，使得進入細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB增多，進而上調(diào)P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達，導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥。相關(guān)研究表明，KRAS突變能夠通過介導(dǎo)PI3K、MEK及ERK等蛋白的信號通路參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥等問題。

3.2.3 非小細(xì)胞肺癌 肺癌是一種常見的惡性腫瘤，可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其 中NSCLC占 肺 癌 的80% ～ 85%[71]。盡管近年對肺癌免疫治療及靶向藥物的研究取得一定進展，但晚期NSCLC患者5年生存率仍不足15%。多種基因突變可誘發(fā)NSCLC，其中KRAS基因突變占20% ～ 30%[72-73]。KRAS突變可通過多條信號通路和多種效應(yīng)因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、惡變和耐藥等促進肺癌的進展，尤其是對NSCLC的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。

KRAS突變主要通過促進腫瘤細(xì)胞增殖，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，促進腫瘤血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移及促進腫瘤細(xì)胞耐藥等方面來促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展。Sparmann等[74]研究發(fā)現(xiàn)，ERK-MAPK通路的激活能夠上調(diào)IL-8的表達，KRAS突變能誘導(dǎo)IL-8的過表達，從而驅(qū)動NSCLC細(xì)胞的增殖惡變。Wu等[75]和Park等[76]研究發(fā)現(xiàn)，KRAS能夠通過激活ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）及PI3K等信號蛋白介導(dǎo)的信號通路來誘導(dǎo)尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinasetype plasminogen，uPA）及其受體（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）的表達，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可控的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移。Shi等[77]利用野生型KRAS過表達和KRAS12D突變的人和小鼠細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)突變KRAS顯著上調(diào)miR-30c和miR-21，并通過抑制NF1、RASA1、BID和RASSF8等關(guān)鍵的腫瘤抑制基因誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性、促進細(xì)胞侵襲和遷移。Tao等[78]通過構(gòu)建 KRASG12D肺癌小鼠模型發(fā)現(xiàn)，KRASG12D的過表達激活ERK信號通路，并以正調(diào)控機制激活核轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear factor 2，Nrf2）通路，從而增加細(xì)胞保護性應(yīng)激反應(yīng)基因Nrf2的轉(zhuǎn)錄，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。Riquelme等[79]研究發(fā)現(xiàn)，與其他KRAS突變相比，KRASG12C突變能夠激活PI3K/AKT信號通路，而激活的AKT能夠磷酸化腫瘤細(xì)胞中的zeste基因增強子同源物2（enhancer ofzestehomolog 2，EZH2），從而促進腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

4 KRAS突變蛋白的小分子抑制劑

當(dāng)與GTP結(jié)合時，活化狀態(tài)的KRAS蛋白表面的Switch-I口袋（S-IP）和Switch-II口袋（S-IIP）處于“關(guān)閉”狀態(tài)，即無法與小分子抑制劑結(jié)合，且其與GTP具有強親和力，細(xì)胞中高濃度的GTP導(dǎo)致靶向GTP結(jié)合位點的競爭性抑制劑難發(fā)揮作用。由于KRAS蛋白結(jié)構(gòu)表面平滑，除GTP結(jié)合位點外，難以尋找能夠與小分子抑制劑產(chǎn)生有效結(jié)合的位點[80-82]。研究人員曾試圖開發(fā)與KRAS效應(yīng)器結(jié)合或靶向KRAS核苷酸結(jié)合位點的小分子抑制劑，以破壞KRAS的Switch-I和Switch-II域活性構(gòu)象、促進GEF的作用[83-85]，但所得化合物在親和力、生物活性和成藥性方面均不盡人意。隨著KRAS突變體結(jié)構(gòu)研究的深入，近年來研究人員通過巧妙途徑設(shè)計獲得直接靶向KRAS突變體的小分子抑制劑。

4.1 ARS-853和ARS-1620

Ostrem等[86]開創(chuàng)性地提出靶向KRAS蛋白的S-IIP進行小分子抑制劑設(shè)計?；谠撍悸罚琖ellspring Biosciences公司研究人員篩選到靶向GDPKRASG12C復(fù)合體的小分子抑制劑ARS-853（1），該化合物通過共價作用結(jié)合于復(fù)合體中KRAS的S-IIP，使其更傾向于與 GDP 結(jié)合，將其鎖定在“失活”構(gòu)象，顯著抑制H358細(xì)胞增殖（IC50= 1.6 μmol · L-1）[87-88]。

Janes等[89]對化合物1進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到細(xì)胞活性是其10倍的喹唑啉化合物ARS-1620（2），其IC50為150 nmol · L-1。共晶研究結(jié)果顯示，與化合物1相比，化合物2增加額外關(guān)鍵作用，其1位N原子與KRASG12C組氨基酸殘基His 95形成氫鍵，使4位彈頭與KRASG12CCys 12以不可逆結(jié)合方式形成的剛性構(gòu)型更穩(wěn)定?；衔?特異性抑制人NSCLC細(xì)胞NCl-H358、人胰腺癌細(xì)胞MIA-PaCa2和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞LU65內(nèi)的KRASG12C蛋白，并顯著抑制這3種腫瘤細(xì)胞的增殖。該化合物具有良好的口服生物利用度（F＞ 60%）和血漿穩(wěn)定性，在MIA-PaCa2細(xì)胞和H358細(xì)胞皮下異種移植小鼠胰腺癌和肺癌模型實驗中，以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長，隨著給藥劑量從200 mg · kg-1增至400 mg · kg-1，KRASG12C突變腫瘤的體積顯著縮小[89]。

4.2 AMG-510

與Wellspring Biosciences公司不同，安進公司瞄準(zhǔn)KRAS蛋白表面隱藏的凹槽進行抑制劑設(shè)計?；衔顰MG-510（3）與KRASG12C突變蛋白Cys 12發(fā)生不可逆結(jié)合，將KRAS蛋白鎖定在與GDP結(jié)合的非激活狀態(tài)，從而特異性地抑制攜帶G12C突變的KRAS蛋白[90-91]。與化合物2相比，化合物3的芳香環(huán)與KRAS上隱藏在His 95位置的表面凹槽結(jié)合，增強與KRASG12C蛋白的相互作用力，其對NCI-H358細(xì)胞的KRASG12C的結(jié)合速率即表觀速率常數(shù)kobs· [I]-1為（1.1×104±1.4×103）mol · L-1· s-1，從而使得細(xì)胞活性顯著提高（NCI-H358 細(xì)胞，IC50= 6 nmol · L-1；MIA PaCa-2 細(xì)胞，IC50= 9 nmol · L-1）[92]。

化合物3能夠抑制KRASG12C信號傳導(dǎo)，選擇性地降低KRASG12C突變細(xì)胞系的活力，而對其他KRAS突變細(xì)胞系無影響[93]。在KRASG12C腫瘤細(xì)胞小鼠模型中，化合物3能夠增強炎性分子趨化因子的表達，從而顯著抑制腫瘤生長[92]。Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示，化合物3對局部晚期/晚期KRASG12C突變NSCLC、結(jié)直腸癌和SCLC的療效良好，患者總疾病控制率達到90%[94]。

4.3 MRTX-849

MRTX-849（4）由Mirati Therapeutics公司設(shè)計，結(jié)合模式與化合物3相似，通過共價方式與KRASG12C的S-IIP口袋中的Cys 12不可逆地結(jié)合，并將其鎖定在非活性GDP結(jié)合狀態(tài)，將KRASG12C蛋白不可逆地鎖定在“關(guān)閉”狀態(tài)，從而阻斷KRAS信號傳導(dǎo)[95-96]。

化合物4能抑制KRASG12C突變癌細(xì)胞系中KRAS下游ERK和核糖體蛋白S6的磷酸化，對絕大多數(shù) KRASG12C突變細(xì)胞系都具有明顯的生長增殖抑制作用（2D培養(yǎng)，IC50為10 ～ 973 nmol · L-1；3D培養(yǎng)，IC50為 0.2 ～ 1 042 nmol · L-1），且對KRASG12C突變蛋白的選擇性是野生型KRAS蛋白的1 000倍以上。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，化合物4可劑量依賴性減小多種腫瘤細(xì)胞的異種移植瘤小鼠的腫瘤生長，包括人肺癌細(xì)胞H2030和H2122，人NSCLC細(xì)胞SW1573和H358，人食管鱗癌細(xì)胞KYSE-410，人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2[97]。

5 結(jié)語與展望

鑒于KRAS突變體的結(jié)構(gòu)特點、其介導(dǎo)信號通路的復(fù)雜性以及KRAS突變型腫瘤的耐藥性，KRAS一度被稱為“不可成藥靶點”。近年來，隨著KRAS突變體結(jié)構(gòu)研究的深入，相關(guān)藥物研發(fā)已取得重大進展，研究人員巧妙地設(shè)計出一些具有廣闊前景的KRAS突變體小分子抑制劑，但目前仍無小分子藥物被批準(zhǔn)上市。KRAS突變型腫瘤治療依然面臨諸多問題，例如KRAS突變型腫瘤容易耐藥。有研究者提出開發(fā)KRAS上游或下游信號通路抑制劑、協(xié)同致死基因抑制劑、腫瘤疫苗及免疫治療等新策略，并希望能通過聯(lián)合用藥的方式解決KRAS突變型腫瘤耐藥問題。