楊文光，高汝青，閆瑾，何旺驍**

（1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院人才高地，陜西 西安 710061；2.南昌大學醫(yī)學院，江西 南昌 330031；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院國家地方聯(lián)合生物診斷與治療中心，陜西 西安710004）

蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡呈現(xiàn)基因產物彼此之間的物理相互作用，是理解細胞生命活動的基礎，例如新陳代謝、細胞周期控制和信號轉導等[1]。目前已經通過遺傳學、生化或生物物理方法（例如熒光共振能量轉移或X射線晶體學）鑒定許多蛋白質之間的相互作用。盡管PPI網絡尚不完整且容易出錯[2-3]，但是對該系統(tǒng)的研究已被證明對于破譯網絡中蛋白質結構和功能之間的關系、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質功能、識別功能一致的模塊和揭示保守的分子相互作用模式至關重要[4-6]。此外，PPI網絡為聯(lián)系不同的疾病與蛋白質[7]，研究藥物-靶點的藥理關系提供了強有力的工具[8-9]。

PPI是細胞進行生命活動的基礎。反過來，這種相互作用的異常改變會擾亂細胞正常的生命活動，并導致包括癌癥在內的許多疾病[10]。PPI界面的突變通常與蛋白質的功能喪失或獲得有關[11]。例如，復制蛋白A是一種參與DNA修復、復制和重組的蛋白質。乳腺癌2號基因（breast cancer 2，BRCA2）發(fā)生癌癥易感性突變使其削弱其與復制蛋白A的相互作用[12]。缺乏這種相互作用可能會抑制對DNA修復蛋白的招募，并最終導致致癌DNA的積累。此外，腫瘤抑制蛋白P53在細胞受到內/外刺激（例如DNA損傷、癌基因活化或氧化應激）時被激活，通過啟動細胞周期阻滯、細胞衰老、DNA修復和細胞凋亡等途徑抑制腫瘤細胞的產生[13]。反之，P53突變會破壞復雜的應激反應途徑網絡，導致受損細胞失控增殖，并最終導致各種類型的腫瘤發(fā)生[14]。因此，PPI已成為生物化學和藥物化學中重要且具有挑戰(zhàn)性的目標[15]。PPI調節(jié)劑的開發(fā)將有助于提高對PPI網絡的認識，促進對疾病致病機制的理解，從而為開發(fā)新的診斷治療策略鋪平道路[9]。多肽由于其獨特的優(yōu)勢，在PPI調節(jié)藥物開發(fā)方面具有極大的應用潛力。迄今為止，已經報道大量成功的多肽類PPI調節(jié)劑，其中在克服多肽成藥瓶頸中付出的努力令人印象深刻。對此，本文綜述近幾年靶向PPI多肽在抗腫瘤藥物中的應用、多肽藥物設計方法和基于納米工程化的多肽遞送手段等方面的研究進展。

1 靶向胞內蛋白-蛋白相互作用的多肽藥物抗 腫瘤機制

相比于小分子藥物，多肽類藥物具有龐大的表面積，與靶蛋白的結合界面更大[16]。因此多肽類PPI調節(jié)劑對靶點具有更高的親和力和專一性，可以發(fā)揮更大的藥效，同時有效降低相關治療副作用。此外，由于多肽抑制劑表面上具有多個相互作用位點，個別結合位點的缺失不會導致結合能力的完全喪失，這一特點使其對靶蛋白結構的細微變化具有更高的容忍性。選擇合理的治療靶點是腫瘤靶向治療的關鍵問題之一，直接決定著腫瘤靶向治療的成敗，針對不同靶點的PPI其抗腫瘤機制也可能不同。本文將靶向PPI多肽藥物的抗腫瘤機制分為以下3種：直接靶向PPI抑制腫瘤細胞、抑制腫瘤免疫相關PPI靶點增敏腫瘤免疫治療以及調控腫瘤微環(huán)境相關PPI增敏腫瘤治療。下面將對近年來針對腫瘤治療的重要靶點進行討論。

1.1 直接靶向PPI抑制腫瘤細胞

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展通常與細胞中某些蛋白的異常表達與降解有關。通過多肽藥物的設計直接靶向抑制或激活腫瘤相關靶點蛋白的表達，是靶向PPI常見的抗腫瘤機制。下面對此類抗腫瘤靶點及相關的多肽藥物進行詳細敘述。

1.1.1 P53激活肽及其衍生多肽 P53蛋白作為一種廣為人知的腫瘤抑制因子，可響應DNA損傷或癌基因激活等細胞應激而調節(jié)多種靶基因的表達，從而介導細胞周期停滯、DNA修復、衰老或凋亡等細胞活動[17]。據不完全統(tǒng)計數據，50%以上的惡性腫瘤細胞中P53基因發(fā)生異常，P53蛋白編碼基因TP53的變異或缺失在12種最常見的腫瘤類型中占比約為42%。突變的P53蛋白不能調節(jié)DNA損傷導致的細胞生長停滯和細胞死亡，直接導致腫瘤的惡性進展和不良預后。因此恢復內源性P53蛋白活性可以誘導細胞凋亡、衰老和先天性炎癥反應來阻止體內惡性腫瘤的生長。

在許多腫瘤中，P53基因以野生型形式存在。而野生型P53基因受到多種機制的負調控不能發(fā)揮正常功能。這些負調控機制的核心，是鼠雙微體基因2（murine doubleminute 2，MDM2）和鼠雙微體基因X（murine doubleminute X，MDMX）對抑癌蛋白P53的協(xié)同抑制[18-20]。因此，同時阻斷轉錄蛋白MDM2和MDMX對P53蛋白的負調控，從而激活腫瘤細胞中的P53蛋白是治療攜帶野生型P53基因癌癥患者的一個合理思路。Pazgier等[21]通過篩選隨機十二肽噬菌體文庫，鑒定幾種P53-MDM2/MDMX抑制肽，其中最有效的多肽抑制劑PMI（多肽序列：TSFAEYWNLLSP）以低濃度親和力與MDM2蛋白和MDMX蛋白結合，比相同長度的野生型P53肽（多肽序列：ETFSDLWKLLPE）結合力強約2個數量級。該發(fā)現(xiàn)破譯P53-MDM2/MDMX高親和力抑制肽的結構基礎，為不同類別P53激活劑的結構設計提供新的依據以及潛在的治療用途。

1.1.2 β-連鎖蛋白抑制肽及其衍生多肽 B細胞淋巴瘤因子9（b-cell lymphoma 9，Bcl9）是一種在人類腫瘤中過度表達的轉錄輔因子。Bcl9與β-連鎖蛋白（β-catenin）相互作用激活Wnt/β-catenin信號，促進其核易位，從而促進腫瘤進展[22]。盡管Wnt/β-catenin途徑在腫瘤發(fā)生中起著關鍵作用，但它也是干細胞增殖和分化所必需的[23]，所以對該途徑進行治療性干預仍然是一個挑戰(zhàn)。因此，靶向Wnt/β-catenin途徑并對腫瘤細胞具有高度特異性的藥物開發(fā)將具有重要的臨床意義。

短肽Bcl9中的3個疏水殘基和2個帶電殘基可與β-catenin中的疏水溝相互作用。因此，該螺旋線很有可能用來阻斷Wnt信號的活性。為此筆者課題組合成了β-catenin/Bcl9抑制肽（β-catenin/Bcl9 inhibitor，BBI）[24]?；跓晒馄竦母偁幗Y合分析表明BBI與Bcl9顯著競爭結合β-catenin。通過與細胞穿透肽R8（多肽序列：RRRRRRRR）相連接，結合肽BBI-R8對Wnt信號超活化細胞系Hep3B的增殖表現(xiàn)出強大的抑制能力。這些結果表明，多肽BBI能通過阻斷Bcl9和β-catenin的相互作用來抑制癌細胞的增殖。筆者課題組進一步設計pH和谷胱甘肽（glutathione，GSH）雙響應的納米雜合物團簇[24]。一系列體外和體內測試表明，該納米雜合物通過阻斷Wnt/β-catenin通路，有力地抑制腫瘤生長和轉移，同時保持了高度有利的生物安全性。以上結果表明多肽BBI可以有效抑制Wnt信號通路的超活化，具有巨大的臨床應用潛力。

多肽自組裝平臺以其獨特的生物相容性和生物降解性，在多靶點抗腫瘤藥物領域具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，受到越來越多的關注。通過表位嫁接和結構設計，筆者課題組將以下2種抗癌肽引入絲瓜種子蛋白（一種天然蛋白質）的拓撲等效位置：1）PMI，P53-MDM2/MDMX十二肽抑制劑；2）Bcl9p，一種通過阻斷β-catenin-Bcl9相互作用來抑制Wnt/β-catenin信號的多肽。通過此多肽嫁接技術設計一種基于多肽的雜交納米平臺Lupbin（見圖1）[25]。它能夠自組裝成一個穩(wěn)定的結構，并同時靶向位于細胞質和細胞核的多個PPI。結果表明，Lupbin通過同時阻斷Wnt/β-catenin信號通路和激活P53信號通路來阻斷腫瘤的生長和轉移，具有良好的體內生物安全性。

圖1 基于多肽的雜交納米平臺（Lupin）Figure 1 Lupbin — a hybrid peptide-based nanoplatform

1.1.3 其他靶點 除上述靶點之外，最近研究發(fā)現(xiàn)了許多新的腫瘤治療靶點。腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）廣 泛 存 在 于多種腫瘤中，在腫瘤進展和免疫抑制中起著關鍵作用[26]。成纖維細胞激活蛋白（fibroblastactivation protein，F(xiàn)AP）在CAF上過表達，被認為是一個普遍的腫瘤靶點。然而，F(xiàn)AP的表達并不局限于腫瘤，針對FAP的全身治療往往會導致嚴重的副作用[27]。為此，Zhou等[28]開發(fā)一種鐵蛋白納米顆粒介導的FAP靶向光動力療法。實驗結果表明，該藥物系統(tǒng)中FAP特異性單鏈可變片段可以有效地靶向并根除腫瘤中的CAF。

近年來，腫瘤細胞內的細胞核和重要的細胞器如線粒體和內質網等成為許多癌癥治療策略的重要靶點[29-31]。最新研究表明，線粒體在癌癥的耐藥性中起到關鍵作用。在此，He等[30]利用線粒體周圍酶的自組裝選擇性靶向肝癌細胞線粒體。包裹著氯霉素（chloramphenicol，CLRP）的肽-脂質結合物最初被線粒體周圍腸激酶切割，隨后CLRP被選擇性地送入癌細胞線粒體，從而抑制線粒體蛋白質合成，誘導細胞色素c釋放到胞漿中，最終導致癌細胞死亡。

1.2 通過抑制腫瘤免疫相關蛋白-蛋白相互作用靶點增 敏腫瘤免疫治療

人造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應中的活化細胞可以產生具有高活性和多功能的肽、蛋白質和糖蛋白。它們在機體的免疫活化和免疫抑制進程中起著重要作用。腫瘤免疫療法通過激活體內免疫細胞達到去除腫瘤細胞的目的。腫瘤免疫療法具有特異性強、作用時間久和副作用少等優(yōu)點[32]。通過肽庫篩選、序列比較或其他相關技術來獲得可以調節(jié)腫瘤患者免疫力的多肽，將在腫瘤治療中發(fā)揮積極作用[33]。

程序性細胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）是一種眾所周知的免疫檢查點受體，它在腫瘤組織的T細胞中過度表達。Han等[34]報道一種靶向吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的納米抑制劑，其可以選擇性地抑制腫瘤微環(huán)境中的IDO通路。該抑制劑是由親水性靶向分子、2個可質子化的組氨酸和1個連接有酯鍵的疏水性IDO抑制劑組成，其具有pH響應解聚和酯催化的藥物釋放性能。該抑制劑可以對腫瘤內IDO活性進行強力持久的抑制，從而極大地增強程序性細胞死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）在體內的治療效果。Li等[35]報道一種近端使能反應（proximity-enabled reactive therapeutics，PERx）的方法來產生共價蛋白藥物。通過遺傳密碼擴展，潛在的生物反應性氨基酸氟硫酸鹽-L-酪氨酸（fluorosulfate-L-tyrosine，F(xiàn)SY）被整合到PD-1。當PD-1與PD-L1相互作用時，F(xiàn)SY才會選擇性地與PD-L1的近端組氨酸反應，從而在體外和體內都能使PD-1與PD-L1不可逆地結合。在免疫人源化小鼠模型中，與非共價野生型PD-1相比，共價PD-1-FSY表現(xiàn)出更強的抗腫瘤作用，并達到等效或優(yōu)于抗PD-L1抗體的治療功效。

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是具有干細胞性質的腫瘤細胞，并能驅動腫瘤轉移和復發(fā)。迄今為止，已經在20多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)CSC。Najafabadi等[36]從CSC中鑒定出乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的A1和A3表位，并研制了用于預防ALDHhighCSC的合成高密度脂蛋白納米盤。納米盤增強了抗原向淋巴結的轉運，并產生了強大的ALDH特異性T細胞反應。該納米盤疫苗聯(lián)合抗PD-L1治療在多種小鼠模型上均顯示出較強的抗腫瘤效果，并可能為CSC的癌癥免疫治療開辟新的途徑。

1.3 調控腫瘤微環(huán)境相關蛋白-蛋白相互作用增敏腫瘤 治療

長期以來，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤研究中一直被忽略。受Paget“種子與土壤”假說的啟發(fā)，越來越多關于TME的研究取得令人矚目的成就[37-39]。TME由腫瘤部位的所有非惡性宿主細胞和非細胞成分組成，包括腫瘤相關成纖維細胞（tumor-associated fibroblasts，TAF）、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、腫瘤相關免疫細胞和內皮細胞。所有這些成分都引起強烈的促結締組織增生反應，極大影響治療劑的輸送效率和治療效果。因此，已經開發(fā)出許多靶向調節(jié)TME相關PPI的多肽藥物來阻止腫瘤的發(fā)展[40]。如促進ECM相關成分(膠原蛋白和透明質酸等)的降解，可以釋放腫瘤位點增加的組織間滲透壓，從而提高治療劑的效率。

炎癥反應，特別是慢性炎癥，是引發(fā)腫瘤的重要原因，并在腫瘤的不同發(fā)展階段發(fā)揮不同的功能。減少炎癥的免疫調節(jié)以重塑TME可能是癌癥治療的重要策略。Ma等[41]開發(fā)一種pH和氧化還原雙重響應性多肽-地塞米松結合物（L-SS-DEX），用于抗腫瘤治療和調節(jié)TME。該藥物不僅在體內和體外均對腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，而且顯著增加CD8+T細胞的浸潤，降低腫瘤內的髓系來源抑制性 細 胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）和調節(jié)性T細胞的數量，成功逆轉腫瘤的免疫抑制微環(huán)境。

此外，抑制腫瘤血管的形成和發(fā)展也是調節(jié)TME治療有希望的策略之一。鑒于此，Li等[42]開發(fā)一種將凝血酶和化療藥物阿霉素（Dox）整合的共遞送納米系統(tǒng)。結果表明，該藥物在腫瘤部位表現(xiàn)出凝血酶的受控釋放，局部引發(fā)腫瘤內血栓形成，從而剝奪腫瘤的營養(yǎng)。同時Dox在腫瘤內的積累和擴散，對腫瘤細胞產生良好的殺傷效果。

2 靶向胞內蛋白-蛋白相互作用的多肽開發(fā)

多肽由于具有良好的生物相容性和結構多樣性，已經成為靶向PPI調節(jié)最可能的候選藥物。然而多肽本身的固有缺陷（蛋白水解抵抗性差和不良細胞內化等）限制治療性肽PPI調節(jié)劑的開發(fā)[43]。研究者為克服這些阻礙已經付出巨大的努力，并取得一系列有價值的成果。以下對多肽藥物靶向PPI的優(yōu)勢與障礙進行詳細敘述，并對多肽藥物的設計手段進行歸納總結。

2.1 抗腫瘤仿生多肽靶向蛋白-蛋白相互作用的優(yōu)勢與 劣勢

2.1.1 優(yōu)勢 PPI的調節(jié)已經通過多種途徑實現(xiàn)，特別是來自天然化合物或通過有機合成的小分子方法近年來被廣泛研究[44]。目前有超過12個小分子PPI調節(jié)劑正在臨床開發(fā)中，預計這些分子的市場價值將在未來5年內超過6億歐元[45]。盡管如此，小分子調節(jié)劑對絕大多數的PPI無明顯效果。目前，制藥行業(yè)開發(fā)特定PPI靶標小分子抑制劑的進展有如下困難：1）小分子藥物參與調節(jié)PPI靶點的作用面積有限；2）小分子在結合蛋白相互作用界面中遇到強大的熱力學障礙；3）難以在化學庫中找到能夠克服這些熱力學障礙的合適化合物。實驗證明克服這些障礙非常具有挑戰(zhàn)性。通常對PPI起作用的小分子抑制劑，常規(guī)高通量篩選的命中率令人失望[46]。

近年來生物藥物（例如抗體、蛋白質和肽）正在作為諸如蛋白質相互作用的靶標抑制劑而不斷出現(xiàn)。相比于小分子藥物，多肽具有以下優(yōu)勢：1）肽本身具備柔韌性，對PPI大的相互作用表面有較強適應性；2）易于模塊化，具有結構多樣性，從而具有更高的選擇性和效力；3）多肽的尺寸限制其在組織中的積累；4）良好的生物相容性[47]，如相比于小分子抑制劑Nutlins，p52-MDM2/MDMX靶向抑制肽PMI對MDM2/MDMX具有更高的親和力[21]。

2.1.2 劣勢 盡管多肽與小分子相比具有一些優(yōu)勢（如對靶點的親和力/特異性較高、毒性較低），但由于多肽的固有缺陷，其一直無法成為候選藥物的主要來源。首先，多肽藥物僅限于已知的生物活性肽靶點，并且表現(xiàn)出較低的效能。此外，由于人體內腎臟的快速清除和血液、腎臟或肝臟的酶消化，肽的短半衰期一直是肽療法的主要問題之一。肽通常在給藥后幾分鐘到幾小時內從血液中清除。因此，目標組織可能缺乏足夠的暴露，使藥物難以產生體內效應。此外，多肽藥物開發(fā)也受到較低的細胞膜通透性和可能包含潛在的免疫原性序列的限制[48]。

針對這些藥理障礙已經開發(fā)許多策略，如通過聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）對目標肽進行修飾還可以保護其免受外來的影響，從而提高其在體內的整體穩(wěn)定性。另外，PEG修飾可以顯著降低某些肽（非普遍）的免疫原性[49]。利用血清白蛋白可以逃避腎臟清除的特性，將干擾素α肽融合到白蛋白C端，在保障藥物效力的同時可以有效延長藥物半衰期。將肽共價連接到血清白蛋白氨基酸34位的游離半胱氨酸也能有效延長治療肽的半衰期[50]。近年來，納米技術提供一種自下而上的方法，可將肽共價或非共價地轉化為具有蛋白水解抗性和細胞膜穿透性的穩(wěn)定結構。一些肽衍生的納米藥物，包括脂質體及大分子衍生的肽納米膠束，肽涂覆的納米顆粒和基于肽的自組裝納米結構表現(xiàn)出優(yōu)越的生物學優(yōu)勢，包括延長體內循環(huán)時間、增強疾病特異性、增強蛋白水解穩(wěn)定性和隨后優(yōu)化的治療功效[51]。

2.2 靶向蛋白-蛋白相互作用的多肽藥物開發(fā)手段

2.2.1 結構輔助設計 許多PPI是由小段多肽介導的，它們具有特定的二級結構以適應相互作用的表面。然而蛋白質片段作為PPI調節(jié)劑存在一些局限性，特別是當從整體蛋白質中分離出短序列多肽段時，往往會喪失其高度的靈活性和三維穩(wěn)定性。對蛋白質片段或多肽進行結構輔助設計以增強其作用效果，是多肽藥物開發(fā)的常用手段[46]，例如提高藥物蛋白水解抗性、靶點親和力以及增強細胞內化等。

Schafmeister等[52]于2000年報道通過復分解反應可以誘導短肽中的α-螺旋構象。α-螺旋肽由于具有更好的親和力、更高的穩(wěn)定性和良好的細胞攝取能力，在調節(jié)PPI的多肽藥物開發(fā)中得到廣泛應用。PPI成功被調節(jié)的例子有原癌基因B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）轉錄產物抗凋亡蛋白BCL-2家族、抗凋亡基因髓樣細胞白血病-1基因（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）轉錄產物MCL-1蛋白[53]、P53-MDM2相互作用[54-55]、Notch信號通路中形成的信號分子三元復合物[56]和Wnt信號通路中的β-catenin/T細胞因子[57]。訂書肽被用來抑制新的抗癌靶點，如通過阻止白血病細胞中Zeste同源物增強子2重組蛋白（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）與胚胎外胚層發(fā)育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）復合，并通過降低EZH2蛋白水平來抑制組蛋白H3第27個氨基酸的三甲基化[58]。

肽介導的蛋白質相互作用還涉及另一種彌漫的二級結構，即β-發(fā)夾結構。這種結構通常由2條反平行的β-鏈組成，并由1個環(huán)序列連接。許多策略都致力于提高這種發(fā)夾的穩(wěn)定性，以調節(jié)PPI[59]。β-發(fā)夾穩(wěn)定肽還可以模擬P53蛋白N端片段中的α-螺旋表位，并以納摩爾級親和力與MDM2結合[60]。受抗體結構的啟發(fā)，穩(wěn)定的β-發(fā)夾結構被用于構建一類新的高效結合肽，該結合肽對多個靶點顯示出納摩爾級親和力和較慢的解離速度。

2.2.2 計算機輔助蛋白設計 計算機輔助蛋白設計（computer aided protein design，CAPD）是指應用計算機技術對蛋白質的結構預測和改造方案進行評估，并作出最佳選擇。目前常見的蛋白質設計軟件主要有PyMOL，PDB Viewer，Accelery Insight II和Discovery Studio等軟件。相較于人力，計算機輔助設計具有容量大、速度快和分析能力強等諸多優(yōu)勢。尤其是隨著計算機硬件和算法的快速升級，其分析能力和速度得到極大的提升。因此計算機輔助設計具有極大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬?。Senior等[61]描述一種AlphaFold算法，通過引入機器學習技術，極大提高蛋白質結構預測的速度和精度。

此外，應用計算機技術還可以對改造的蛋白質進行預測。Sun等[62]基于成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）與成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）形成的復合物結構，制備3種FGF2的變體，并基于計算機輔助設計揭示了蛋白質的結構特征。結果表明，對蛋白質進行有效的修飾可以提高其活性和穩(wěn)定性。這種蛋白質修飾策略（如結構導向的聚乙二醇化）為蛋白質改造提供了新的方法。

2.2.3 多肽庫篩選 1）噬菌體展示 將生物技術用于藥物探索已經成為現(xiàn)實。其中噬菌體展示是靶向PPI多肽藥物開發(fā)的常用工具，并廣泛用于為高通量篩選（high throughput screening，HTS）建立各種肽庫[46]。眾所周知，該方法具有高變異率以及“親和力選擇”的獨特優(yōu)勢[63]。如Zhou等[64]發(fā)現(xiàn)一個新的免疫檢查點：含免疫球蛋白和 ITIM 結構域蛋白的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT），并使用鏡像噬菌體展示對TIGIT的D-對映體進行生物淘洗。篩選出的D肽D-TBP-3可以占據PPI結合界面，并有效阻斷TIGIT與脊髓灰質炎病毒受體（poliovirus receptor，PVR）的相互作用。尤其在抗PD-1耐藥腫瘤模型中，D-TBP-3可以抑制腫瘤的生長和轉移，有望成為腫瘤免疫治療的潛在候選藥物。

Li等[65]對噬菌體進行基因工程改造，使其側壁上顯示出許多已鑒定的血管生成素結合肽副本，并在其尖端上顯示出多個乳腺腫瘤歸巢肽副本。由于可以通過噬菌體展示發(fā)現(xiàn)歸巢肽，并且可以針對任何特定癌癥進行定制，這種血管生成素結合噬菌體是通用的“即插即用”腫瘤歸巢肽治療藥物。Kong等[66]基于噬菌體的進化和選擇開發(fā)一種生成目標特異性肽（相對分子質量小于1 600）的方法。通過該方法產生具有納摩爾級親和力的凝血因子抑制劑，并為白介素23受體開發(fā)了一種抗腸胃蛋白酶的肽拮抗劑。該方法可用于設計胃腸道穩(wěn)定且親和力高的靶向肽，有助于口服多肽藥物的開發(fā)。

2）核糖體和mRNA展示 體外技術的發(fā)展已解決在活細胞中建立隨機肽庫的局限性，如核糖體展示和mRNA展示等，這些技術不僅與噬菌體展示同樣具有高度多樣性，并且效率得到顯著提高[67]。

在核糖體上展示的隨機肽庫正在成為體外選擇生物學相關大分子（包括表位、拮抗劑、酶和細胞表面受體）的新工具。核糖體展示是一種無細胞的系統(tǒng)，通過形成穩(wěn)定的蛋白質-核糖體-mRNA復合物，并通過淘選和反向的迭代循環(huán)選擇功能性的新型蛋白質，從而將各個新型蛋白質（表型）與其相應的mRNA（基因型）偶聯(lián)[68]?；诖朔椒?，Yang等[68]使用大腸埃希菌S30裂解物構建了高復雜度的隨機肽庫（肽庫中多肽數目超過1014個）。此外，核糖體展示已用于篩選雌激素受體表面，并發(fā)現(xiàn)了新的富含脯氨酸的肽結合劑[69]。

通過生物技術制備肽庫的最重要進展之一是遺傳密碼的合成重編程，它允許在肽序列中同時引入多個非蛋白質氨基酸。該技術涉及將mRNA展示與突變的氨酰t-RNA合成酶結合使用，該酶可催化包含給定氨基酸反密碼子序列的RNA鏈的氨酰化[70]。Morimoto等[70]開發(fā)了更多用途的氨?；呋瘎?，并與適當的翻譯系統(tǒng)配合使用，使該系統(tǒng)完成蛋白質和含非天然氨基酸肽的合成工作[71]。使用mRNA展示的實例是成功分離與凝血酶低親和力的非天然環(huán)狀肽[72]，以及發(fā)現(xiàn)拮抗活細胞中血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的大環(huán)狀肽[73]。

3 靶向胞內蛋白-蛋白相互作用的多肽成藥性 改造

多肽具有以下缺陷：1）抵抗消化系統(tǒng)蛋白水解酶并且血漿降解的穩(wěn)定性低；2）容易被肝臟和脾臟快速清除；3）穿越生理障礙的能力差；4）潛在的免疫原性等，極大地限制其作為PPI調節(jié)藥物的開發(fā)。為此，許多化學修飾和智能連接體已被引入PPI調節(jié)劑的開發(fā)[74]。這些化學修飾不僅使多肽藥物具有細胞和組織通透特性，還可以降低蛋白質水解降解和提高生物利用度。

近年來，抗腫瘤納米系統(tǒng)作為藥物載體得到廣泛應用。由于肽的生理功能的多樣性，將肽引入抗腫瘤納米系統(tǒng)是合理的。肽與納米材料的集成具有互補優(yōu)勢，不僅避免體內肽的快速降解，而且使納米系統(tǒng)更加智能化和功能多樣化[75-76]。下面對多肽藥物中常見的化學修飾，以及基于抗腫瘤納米系統(tǒng)的多肽遞送手段進行介紹。

3.1 基于多肽修飾的化學手段

化學修飾是設計多肽的重要手段。其中，側鏈結合和主鏈環(huán)化等化學修飾方法被廣泛應用。

3.1.1 主鏈環(huán)化 環(huán)肽可分為2種類型：均環(huán)肽和雜環(huán)肽。均環(huán)肽本質上是形成分子內肽鍵的過程。影響環(huán)肽形成的因素是環(huán)的大小，如具有7個以上氨基酸殘基的多肽可以順利成環(huán)。存在于雜環(huán)肽的氨基酸殘基之間的非酰胺鍵主要是酯鍵和二硫鍵。前者與酰胺鍵的形成過程相似，而后者實質是將2個半胱氨酸的巰基氧化成二硫鍵。

較短的線性肽很容易被生物體內的各種生物酶降解。由于環(huán)狀肽不具有C末端和N末端，因此可以消除或減弱肽酶的降解作用，從而提高多肽在體內的穩(wěn)定性。Wang等[77]報道一種超分子管水凝膠（tubustecan，TT），通過組織穿透環(huán)肽iRGD與2個喜樹堿藥物單元的共價連接產生一種TT前藥兩親體，可結合成管狀超分子聚合物。其中iRGD序列既是腫瘤結合肽又是組織穿透肽。完整的環(huán)狀肽可與腫瘤相關內皮細胞表面過度表達的αv整合素結合。iRGD切割后的RGDR序列可以通過與腫瘤細胞過度表達的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和神經纖毛蛋白1（neuropilin-l，NRP-1）結合來刺激藥物在腫瘤中的穿透和促進細胞內吞。結果表明，該藥物載體有長期持續(xù)的藥物釋放時間。由于iRGD環(huán)肽的整合，藥物有效地滲透到實體腫瘤，并得到增強的治療效果。

同時由于環(huán)狀結構對構象的限制增加，有可能提高肽與受體的親和力和選擇性，從而增強多肽藥物活性并降低副作用。Shen等[78]進行的研究表明，對于一系列實體瘤，用近紅外染料標記的環(huán)狀八肽可選擇性結合磷酸化膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2，ANXA2），且在高鈣水平下具有高親和力。該發(fā)現(xiàn)表明，大多數實體瘤的微環(huán)境中都存在高水平的ANXA2磷酸化與鈣含量升高。八肽可能廣泛用于選擇性腫瘤成像以及作為載體將藥物遞送至實體瘤部位。α-促黑素細胞激素環(huán)狀類似肽可以有效靶向腫瘤細胞表面過度表達的黑皮質素受體。Zhang等[79]在二氧化硅納米顆粒上修飾α-促黑素細胞激素環(huán)狀類似肽，以提高對腫瘤細胞靶向能力。結果表明，該納米顆粒在同基因小鼠黑色素瘤細胞和人黑色素瘤細胞移植模型中具有選擇性的腫瘤攝取和良好的生物分布特性。

3.1.2 側鏈修飾 非標準氨基酸的加入不僅可以改善肽的理化性質，而且可以增加肽的新功能[80]。多肽的組裝后修飾是獲得功能化多肽并用于生物學研究和藥物開發(fā)的有效途徑。大多數肽的修飾方法主要是基于氨基、羥基、羧基和硫醇等“活性”官能團的轉化[81]，對酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和組氨酸的芳香C(sp2)-H功能化也進行廣泛的研究。相比之下，由于肽鏈的脂族側鏈的惰性和控制區(qū)域選擇性的困難，對C(sp3)-H功能化的研究報道較少[82-83]。

近年來，已開發(fā)幾種用于N-或C-末端肽的C(sp3)-H功能化的定向策略。Rodríguez等[84]報道通過在N-末端安裝雙齒輔助劑來實現(xiàn)N-末端殘基Val、Ile和Tle的γ/δ-C(sp3)-H功 能 化，而Mondal等[85]利用C-連接的雙齒輔助劑作為導向基團開發(fā)了C-末端Pro和Ala的β-C(sp3)-H芳基化。在沒有輔助劑的情況下，N-端和C-端的天然氨基和羧基也被用作導向基團，其分別促進短肽的N-端或C-端Tle的γ-C(sp3)-H芳基化。此外，Weng等[86]報道了由天冬酰胺的側鏈酰胺基促進的N-末端Ala的β-C(sp3)-H芳基化。此外，Gong等[87]開發(fā)了一種主鏈導向策略，并實現(xiàn)了N-末端Ala的高效β-C(sp3)-H芳基化、乙酰氧基化和炔基化。使用該策略，Tang等[88]進一步報道利用線性肽的分子內β-C(sp3)-H芳基化合成環(huán)肽。同時Mondal等[85]也報道了β-C(sp3)-H功能化三唑類肽，并且這些方法被成功地應用于修飾內部Ala。

3.2 基于納米工程化的遞送策略

目前，已經設計和利用各種納米粒子來增強多肽物理和生物穩(wěn)定性，以促進細胞和組織滲透，并有效地促進細胞內多肽遞送。包括脂質體、聚合物、蛋白質復合物、無機材料在內的各種納米載體系統(tǒng)已被證明是有希望的遞送策略[51]。

3.2.1 基于囊泡的遞送策略 1964年，Bangham等[89]發(fā)現(xiàn)脂質體可以作為輸送囊泡，隨后這種載藥系統(tǒng)得到廣泛研究。截至目前，已經有幾種基于小分子藥物的脂質體產品被美國FDA批準[90]。脂質體是具有內腔的雙層囊泡，由兩親性脂質或磷脂組成。由于其特殊的結構，可以將各種疏水性或親水性藥物填充到脂質體中，然后通過內吞作用或脂質體-細胞融合作用傳遞到細胞中。例如，為提高治療效果，Jiang等[91]設計凝膠-脂質體復合物共傳遞2種抗癌藥物，即腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）和Dox。在此，Dox首先被封裝到由細胞膜穿透肽修飾的脂質體中。由酶降解的透明質酸（hualuronic acid，HA）組成的交聯(lián)凝膠附著在脂質體的表面。同時，抗癌劑TRAIL被包封在外殼中。透明質酸酶在TME中高度過表達，這可能會降解HA外殼，從而促進TRAIL與死亡受體結合并促進腫瘤細胞對Dox的攝取。體內試驗表明，這種多功能凝膠-脂質體系統(tǒng)對人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）異種移植動物模型的腫瘤生長有明顯的抑制作用。

近年來，外泌體作為一種藥物遞送系統(tǒng)受到越來越多的關注[90]。作為一種內源性囊泡，外泌體具有低免疫原性、低毒性和較長的血液循環(huán)時間等優(yōu)勢。Li等[92]開發(fā)了一種巨噬細胞外泌體包被的納米平臺，并將其用于三陰性乳腺癌的靶向藥物遞送和化療。在外泌體膜表面修飾可以特異結合腫瘤細胞上過表達的間質-上皮轉化因子的多肽，以提高對腫瘤的靶向效果。實驗結果表明，該外泌體膜包被的納米顆?？梢燥@著提高Dox的細胞攝取效率和抗腫瘤效果，并且該納米載體在體內具有良好的腫瘤靶向效應和抑制效果。

3.2.2 基于仿生納米顆粒的遞送策略 在不同的仿生策略中，利用細胞膜材料制備納米顆粒提供了一種獨特的自上而下的方法，該方法具有能夠完全復制源細胞表面抗原多樣性的優(yōu)勢，并且避開了蛋白質組學方面的研究和多價納米顆粒功能化的工程障礙。使用這種新興方法，研究人員成功地創(chuàng)建了具有許多理想功能的納米顆粒。包括具有長循環(huán)特性的紅細胞膜覆蓋的納米顆粒，具有癌癥靶向能力的干細胞膜來源的納米顆粒，和具有穿越內皮細胞能力的白細胞膜涂層的納米顆粒。癌細胞膜覆蓋的納米粒子具備同源靶向能力和免疫逃逸能力，被廣泛用于抗腫瘤納米顆粒的設計[93]。Fang等[94]報道一種基于FePSe3的仿生2D納米片，其中抗PD-1肽作為納米片的內部成分，而結腸癌CT26細胞膜作為納米外殼，形成具備核磁共振成像和光聲成像能力以及協(xié)同光熱和免疫療法的抗癌劑。試驗結果表明，由于癌細胞膜的覆蓋，納米顆粒具有良好的同源腫瘤細胞內化能力和免疫逃逸能力。此外，抗PD-1肽可阻斷PD-1/PD-L1通路并激活細胞毒性T細胞，從而產生強大的抗腫瘤免疫效果。

在自然界中，許多病原體，例如病毒和細菌，在納米級或微米級都具有柔軟的棒狀幾何形狀，它們具有高度滲透能力[95]。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)，有研究報道與病原體類似的納米顆粒具有很強的腫瘤富集能力和細胞內在化能力。為此，筆者課題組通過誘導硫醇自組裝構建一種柔性鑭系元素-肽納米棒（lanthanide-peptide-derived nanorod，LProd）[96]。作為腫瘤診斷和肽衍生療法的治療平臺，LProd具有生物相容性好、穩(wěn)定性強和熒光強度高的特點。筆者課題組將P53-MDM2/MDMX抑制劑PMI（多肽序列：TSFAEYWNLLSP）引入LProd。為了增強腫瘤靶向，在LProd表面組裝了白細胞分化抗原13（CD13)特異性結合環(huán)肽iNGR（多肽序列：CRNGRGPDC）。實驗表明，LProd具有比球形鑭系元素-肽納米顆粒更強的腫瘤特異性積累，并通過PMI激活腫瘤抑制蛋白P53，有力地抑制人結腸癌小鼠模型中的腫瘤生長。

3.2.3 基于無機/有機顆粒的遞送策略 無機納米粒子具有尺寸可調、表面改性等優(yōu)點，能有效地進入靶細胞，且毒性小、循環(huán)時間長，是近年來研究的熱點。無論是通過非共價相互作用還是共價連接，多肽藥物都可以被這些納米粒子包裹。目前廣泛使用的無機納米顆粒主要有硅納米顆粒、金屬納米顆粒（aurum nanoparticles，AuNP）、碳基納米材料等。硅基納米顆粒具有成本低、生物相容性好、理化穩(wěn)定性好、表面功能化程度高、臨床發(fā)展水平高等特點，已被廣泛應用于藥物遞送的載體[97]。如Nie等[98]開發(fā)了一種以介孔二氧化硅納米粒子為支撐的蛋黃殼結構的納米顆粒載體。結果表明，該封裝有小劑量Dox和聚（ADP-核糖）聚合酶抑制劑的納米載體比一線化療藥物鹽酸阿霉素有更顯著的抗腫瘤作用。

金屬基納米顆粒由于其尺寸小、形狀不可變和種類多樣性等優(yōu)點被認為是一種很有前途的給藥系統(tǒng)。其中以AuNP為基礎的納米載體具有良好的理化穩(wěn)定性和生物相容性，因此，基于AuNP的療法已被廣泛應用于臨床試驗中。然而，肽的復雜化學性質（疏水性、電荷和氧化還原）始終不利于結合后膠態(tài)AuNp的穩(wěn)態(tài)，隨后導致在離子濃度升高的生理條件下的聚集甚至沉淀[51]。對此，筆者課題組將HAuCl4和β-catenin-Bcl9相互作用的抑制肽BBI共聚，形成金-肽納米雜化物[24]。這種納米雜化物對多肽藥物有較高的裝載效率，而且具備低pH和GSH響應特性。通過體外和體內測試，證明該納米顆粒充分發(fā)揮抑制肽BBI對Wnt/β-catenin通路的損傷作用，有力地抑制腫瘤生長和轉移，同時保持高度有利的生物安全性（見圖2）。

圖2 自組裝抗腫瘤多肽膠束Figure 2 Self-assembly of therapeutic peptide into stimuli-responsive clustered nanohybrids for cancer-targeted therapy

與聚合物、脂質、無機納米顆粒等運輸載體相比，蛋白質納米粒子具有生物相容性、生物功能性、生物環(huán)境中的分子識別性、分子多樣性和可生物降解成氨基酸等優(yōu)點。目前，蛋白質載體已用于特定細胞靶向的藥物遞送。受絲瓜種子中的一種天然蛋白質的啟發(fā)，筆者課題組設計了一種基于多肽的雜交納米平臺[25]，它能夠自我組裝成一個穩(wěn)定的上部結構，并同時瞄準位于細胞質和細胞核的多個PPI。結果表明，該納米雜交平臺能有效地穿透細胞膜，擺脫內質體依賴性降解，進而分解成游離單體，廣泛分布于胞漿和細胞核中。重要的是，這種納米平臺可以發(fā)揮多肽藥物的生物功能，且具有良好的體內生物安全性。筆者課題組的策略擴展自組裝納米藥物在靶向細胞間PPI的應用，并可能為治療包括腫瘤在內的各種人類疾病的肽治療方法的發(fā)展注入新的活力。

此外，筆者課題組還開發(fā)了一種新的納米工程大分子藥物的新策略，即通過一種多肽PSP（多肽序列：VVVVVHHRGDC）直接與藥物結合成為PSP藥物單體，最終趨向于自組裝成形狀和電荷量由TME觸發(fā)的納米殼[99]。作為概念證明，PSP與腫瘤抑制因子P53的D肽激活劑D-PMI（相對分子質量約為1 492）結合生成直徑為80 nm的空心球PSP-DPMI。實驗結果表明，基于PSP的自組裝成功地賦予D-PMI延長的體內循環(huán)時間和高腫瘤細胞特異性的細胞內積累。最終PSP-DPMI納米殼通過激活P53信號通路在體內（外）有效地抑制腫瘤生長，同時保持良好的體內安全性。

4 結語與展望

盡管傳統(tǒng)的腫瘤診斷和治療策略在臨床應用中具有許多優(yōu)勢（如良好的腫瘤抑制作用、眾多的治療評價和豐富的臨床經驗），但同時也面臨著靶向性不理想、藥物生物利用度低、副作用嚴重等諸多挑戰(zhàn)。近幾十年來，由于各種生物活性肽的獨特優(yōu)勢，組合肽庫的迅速發(fā)展成為推動針對腫瘤治療的靶向PPI多肽藥物開發(fā)的強大動力。作為諸多抗腫瘤系統(tǒng)的組成部分，多肽藥物可以靶向腫瘤中的PPI并對其進行調節(jié)。其獨特的結構特點和特殊的生物活性，大大提高了治療效果。目前，靶向PPI多肽藥物有以下發(fā)展趨勢：

1）治療靶點的選擇方面。大多數傳統(tǒng)藥物設計策略旨在設計針對一個靶點的具有高度選擇性的化合物，以達到治療效果。多肽由于其結構優(yōu)勢，可同時作用于多個治療靶點。從治療目標的疾病途徑和PPI網絡的角度出發(fā)，使多肽藥物在PPI網絡中表現(xiàn)出特殊的拓撲結構，從而達到更好的治療效果。

2）提高多肽藥物的穩(wěn)定性和生物可利用性方面。設計具有理想的生物活性、穩(wěn)定性和可生物利用性的多肽藥物仍然是一項極其艱巨的任務。解決諸如蛋白降解和不良細胞內在化等問題是目前研究的主要目標。目前研究人員已經提出諸如肽修飾（如骨架循環(huán)、訂書肽和非天然氨基酸摻入）等許多解決方案。盡管還有許多問題亟需解決，該領域仍有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3）多肽藥物的成藥性改造方面。近年來納米材料在抗腫瘤藥物開發(fā)中具有獨特的功能和各自的優(yōu)勢。靶向PPI多肽與各種納米系統(tǒng)結合展示出前所未有的優(yōu)越性和多功能性。多肽可以很容易地被整合到不同的納米材料中，從而開發(fā)出具有優(yōu)良腫瘤治療效果的抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。

總之，靶向PPI多肽在腫瘤治療中具有巨大的潛力，相信其在生物醫(yī)學領域將發(fā)揮更大的作用。