紀梅芳,許惠春

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361000)

原發(fā)性肝癌在臨床被診斷時多數(shù)患者處于中晚期,失去手術(shù)治療的機會[1]。因此,發(fā)現(xiàn)對人體正常組織損傷小的有效藥物已成為肝癌治療的關(guān)鍵。細胞自噬是在能量貧乏、外界刺激等壓力下,為了維持細胞的穩(wěn)態(tài),機體通過降解細胞內(nèi)變性、損傷、衰老的細胞器回收利用營養(yǎng)物質(zhì),實現(xiàn)細胞自身代謝需要和細胞器的更新。細胞自噬一方面促進細胞死亡,另一方面能夠促進細胞的存活。大多數(shù)文獻認為自噬可抑制腫瘤的形成[2-3]。在腫瘤早期,自噬能限制腫瘤中的壞死與炎癥,從而間接抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。因此,對于細胞自噬的相關(guān)研究,有助于深入了解腫瘤的發(fā)病機制,指導(dǎo)臨床診療。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要成分,其成分中藥理活性最大的即柴胡皂苷D(SSD)[4]。其可以調(diào)節(jié)免疫因子,對于抗炎、抗病毒、護肝等均有顯著作用,毒副作用小[5-6]。本文目的在探討柴胡皂甙D(SSD)對人肝癌細胞自噬水平的影響,為肝癌治療提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 研究材料

人肝癌細胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721以及Huh7均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

所有細胞分三組,對照組、SSD組、SSD+自噬抑制劑3-MA組。對照組不做任何處理。SSD組的細胞采用20 mM的SSD處理48小時。SSD+自噬抑制劑3-MA組的細胞同時采用20 mM的SSD和10 mM 的3-MA處理48小時。

1.2.2 MTT法檢測SSD對于肝癌細胞體外增殖的影響

將對數(shù)生長期的人肝癌細胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細胞懸浮液。將細胞以5×103細胞/孔的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中。將其置于37°C和5% CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜。第二天,從培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基,向培養(yǎng)基100μL中添加20 mM SSD。常規(guī)培養(yǎng)72小時后,向每個培養(yǎng)皿中添加20μL MTT(5 mg/mL)。常規(guī)培養(yǎng)4小時后,加入150μL二甲基亞砜溶液以吸收上清液,并在無光條件下休克10分鐘。將96孔培養(yǎng)板置于微孔板讀取器中,檢測每個孔在490 nm處的吸光度值。

1.2.3 克隆形成試驗

將對數(shù)生長期的人肝癌細胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細胞懸浮液。以1×103細胞/孔的密度,將細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,并在37℃的5% CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜。第二天,從孔中取出培養(yǎng)基,并向培養(yǎng)基中添加20 mM SSD 100μL。常規(guī)培養(yǎng)持續(xù)2周,每3天更換一次液體。將培養(yǎng)基從孔中吸出,用4%多聚甲醛固定15分鐘,用0.1%結(jié)晶紫染色5分鐘。用去離子水沖洗后,用數(shù)碼相機記錄細胞克隆,并進行定量(Bio-RAD),克隆形成率(%)=藥物處理組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將對數(shù)生長期的人肝癌細胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細胞懸浮液。以2×105細胞/孔的密度,將細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,并在37℃的5% CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜。第二天,更換含有20 mM SSD的培養(yǎng)基,用胰蛋白酶消化細胞,離心,并在常規(guī)培養(yǎng)24小時后收集。用PBS洗滌細胞兩次,然后用250μL的結(jié)合緩沖液懸浮,并將細胞濃度調(diào)整為1×106細胞/mL。

1.2.5 肝癌細胞p-AKT、p-AMPK、LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

加熱融化試劑盒三種試劑,在冰上充分混合。血漿蛋白提取的適宜試驗劑量；加入PMSF(1∶10)。在最初的5分鐘內(nèi),PMSF增加了核蛋白提取試劑的用量。用EDTA溶液消化PBS 6cm培養(yǎng)皿(90%密度)中的細胞,并將細胞吹倒。離心速度為12000 RPM,離心管控制幾分鐘。每52μL細胞用PMSF細胞質(zhì)試劑沉淀520μL,最大速度和嚴重電擊5秒,細胞沉淀完全懸浮和分散,冰浴10min；B高速下5秒最大振動26μL,冰浴1分鐘,4℃下12000g離心5分鐘；立即排空預(yù)冷EP管(避免接觸從細胞質(zhì)蛋白質(zhì)中提取的沉淀物),以獲得。取等量樣品,與5份樣品X緩沖液混合,煮沸5分鐘,在冰水中快速冷卻。通過電泳分離10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠,并將蛋白質(zhì)分離方法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。將聚偏氟乙烯薄膜浸入密封溶液中,并在室溫下密封1小時。取下封閉的PVDF膜,用小袋沖洗,并在4攝氏度的夜間溫度下培養(yǎng)。沖洗3次。將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含有兩種電抗的小袋中,并在室溫下孵育。清洗三次后,將PVDF膜置于塑料膜上,取適量ECL試劑5分鐘,將凝膠成像分析儀置于成像系統(tǒng)中。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SSD抑制肝癌細胞的增殖

SSD干預(yù)48小時后,與對照組相比,人類肝癌細胞PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細胞的活性分別下降(19.49±2.92)%、(45.41±7.95)%、(53.84±5.53)%和(64.04±4.36)%,差異顯著(P<0.05)。SSD+3-MA組細胞活性與對照組無顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD可以顯著抑制肝癌細胞的活性,這種抑制是通過誘導(dǎo)肝癌細胞自噬來實現(xiàn)的。見圖1。

圖1 SSD抑制肝癌細胞的增殖

2.2 SSD抑制肝癌細胞的克隆形成

SSD處理2周后,與對照組相比,人類肝癌細胞PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細胞克隆數(shù)分別減少(57.11±6.55)%、(47.23±5.15)%、(51.45±5.56)%和(45.45±6.75)%(P<0.05)。SSD+3-MA組克隆數(shù)與對照組無顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD能顯著抑制HCC細胞的克隆形成,這種抑制是通過誘導(dǎo)HCC細胞自噬來實現(xiàn)的。見圖2。

圖2 SSD抑制肝癌細胞的克隆形成

2.3 SSD誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生凋亡

數(shù)據(jù)顯示,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細胞的凋亡率分別為(11.67±1.17)%、(17.54±1.83)%、(15.45±1.55)%、(15.54±1.57)%,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。SSD+3-MA組細胞凋亡率與對照組差異不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD可以誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,這種誘導(dǎo)是通過誘導(dǎo)肝癌細胞自噬來實現(xiàn)的。見圖3。

2.4 SSD誘導(dǎo)肝癌細胞中自噬小體的形成

經(jīng)過SSD處理后,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721以及Huh7的細胞中自噬小體大量增加。而對照組細胞和SSD+3-MA組的細胞的細胞并未出現(xiàn)自噬小體。見圖4。

圖4 SSD誘導(dǎo)肝癌細胞中自噬小體的形成

2.5 SSD通過AMPK/mTOR信號傳導(dǎo)通路促進肝癌細胞自噬

estern blot顯示,SSD處理后p-AKT不表達,而p-AMPK蛋白表達增加。見圖5。

圖5 Western-blot條帶圖

3 討論

肝癌比較隱匿,發(fā)現(xiàn)確診時多為晚期,嚴重威脅人類生命健康[7-8]。柴胡在中醫(yī)中有著悠久的使用歷史,性微寒,有疏肝解郁、升陽益氣之功效。柴胡中的SSD具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用,毒副作用小。SSD作為一種毒副作用小的中藥提取物,在原發(fā)性肝癌的防治方面取得了顯著的成就[9]。

本研究選擇人肝癌細胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7作為體外細胞實驗的細胞模型,采用SSD進行干預(yù)。結(jié)果顯示,SSD干預(yù)48小時后,細胞活性顯著低于對照組(P<0.05),證實SSD在體外可以抑制這4個HCC細胞的增殖,這與SSD在其他腫瘤細胞中的結(jié)果一致[10]。此外,在加入自噬S抑制劑3-MA后,對照組和對照組之間的細胞活性沒有顯著差異(P>0.05),表明SSD的抑制作用是通過誘導(dǎo)HCC細胞自噬實現(xiàn)的。此外,本研究還進一步研究了SSD對肝癌細胞克隆形成的影響。SSD治療2周后,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細胞克隆數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。這些結(jié)果表明,SSD能顯著抑制HCC細胞的克隆形成,而SSD+3-MA組的克隆形成數(shù)量與對照組無顯著差異(P>0.05),表明這種抑制是通過誘導(dǎo)HCC細胞自噬實現(xiàn)。

本研究顯示SSD組與對照組相比,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明,SSD在誘導(dǎo)細胞凋亡方面作用顯著,從而抑制肝癌細胞增值[11]。此外,SSD+3-MA組的細胞凋亡率與對照組差異不明顯(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD通過誘導(dǎo)肝癌細胞自噬來以致細胞凋亡。此外,本研究還通過電子顯微鏡研究了SSD對肝癌細胞自噬體的影響。結(jié)果表明,與對照組和SSD+3-MA組相比,SSD組自噬體數(shù)量顯著增加,提示SSD能顯著誘導(dǎo)肝癌細胞自噬。研究顯示[12]AMPK通過磷酸化自噬基因Beclin1的絲氨酸93、96位點從而影響VPS34的活性。本研究結(jié)果提示,SSD通過AMPK/mTOR信號傳導(dǎo)來誘導(dǎo)肝癌細胞自噬。

綜上所述,SSD通過AMPK/mTOR信號傳導(dǎo)通路而達成的來誘導(dǎo)肝癌細胞自噬,促進癌細胞凋亡,對肝癌的臨床治療有借鑒意義。