馬京升，張紅星，謝遠紅，金君華

當今世界酒文化盛行，飲酒者與飲酒量日益增加，慢性酒精損傷作為一種常見的酒精相關(guān)疾病，主要包括酒精性肝損傷[1]，酒精性神經(jīng)損傷[2]，酒精性胃損傷[3]，酒精性生殖系統(tǒng)損傷[4]，酒精性骨髓及造血系統(tǒng)損傷[5]，酒精性免疫系統(tǒng)損傷，酒精性致癌[6]，對其治療方面研究很有必要。慢性酒精損傷的成因比較復雜，盡管大家一直關(guān)注這方面的研究，但其機理尚未明確[7-8]。近些年來，不少益生菌表現(xiàn)出對慢性酒精損傷的治療效果，特別是在胃損傷、肝損傷、腸道損傷方面的治療效果良好，且尚未報道副作用，受到學術(shù)界廣泛關(guān)注[8-9]。有確切證據(jù)表明，酒精性肝病與腸上皮頂端交界復合體被破壞，黏膜屏障功能障礙以及腸道內(nèi)脂多糖或內(nèi)毒素進入體循環(huán)有關(guān)[10]。研究表明植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌CCFM1107、發(fā)酵乳桿菌ZYL0401、發(fā)酵乳桿菌LA12、長雙歧桿菌LC67、長雙歧桿菌LC27 及長雙歧桿菌LC67 和LC27 混合物可以通過降低腸道通透性，增強腸道黏膜屏障功能等途徑來減輕酒精誘導的腸道上皮損傷及肝臟損傷，然而益生菌對于酒精損傷的干預效果及其作用途徑具有菌株特異性[8，11-14]。植物乳桿菌Zhang-LL 具有良好的胃腸道耐受性，易定植于生物胃腸道內(nèi)[15-16]。使用植物乳桿菌Zhang-LL 對葡聚糖硫酸鈉誘導的慢性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠進行干涉，發(fā)現(xiàn)其可有效改善大鼠的體態(tài)、腸道形態(tài)、通透性、菌群結(jié)構(gòu)以及免疫能力[17]。本研究將低、高劑量植物乳桿菌Zhang-LL 活細胞及無細胞的發(fā)酵上清液與酒精同時灌胃給ICR 小鼠，在12 周的試驗周期結(jié)束后評價植物乳桿菌Zhang-LL 在酒精損傷對機體負面影響方面的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗原材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 本試驗使用的植物乳桿菌Zhang-LL（Lactobacillus plantarum Zhang-LL，CGMCC 6939），北京農(nóng)學院功能乳品實驗室保藏菌種。

1.1.2 實驗動物 SPF 級ICR 小鼠90 只，體重（34±2）g，7 周齡，雄性。小鼠集中在中國農(nóng)業(yè)大學清潔級實驗動物房喂養(yǎng)，濕度：50%～60%，溫度：20～23 ℃，標準配方桿狀飼料喂養(yǎng)，墊料為玉米芯墊料或木須墊料，完全自由進水進食。

1.1.3 溶液的配制[18]KHBB 緩沖液：8.4 mmol/L HEPES 緩沖液，119 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L CaCl2，11 mmol/L 葡萄糖pH 7.4。

FITC-dextran 溶液：用1 mL KHBB 溶液溶解40 mg 異硫氰酸熒光素（FITC，F(xiàn)D-4，Sigma），配制成40 mg/mL 的溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物乳桿菌的活化及傳代處理 活化：取凍存植物乳桿菌Zhang-LL 保菌液，在液體MRS培養(yǎng)基試管內(nèi)，37 ℃條件下培養(yǎng)活化，并傳代2次，取3 代在4 ℃下6 000 r/min 離心10 min，保留上清液。用滅菌的生理鹽水配制濃度為1.0×108CFU/mL 和1.0×1010CFU/mL 的菌體活細胞懸液，將離心所得上清液通過0.22 μm 無菌濾膜處理，用于灌胃。

1.2.2 實驗動物分組與處理 ICR 小鼠1 籠5 只分籠喂養(yǎng)，自由進食飲水，定時更換墊料。適應性喂養(yǎng)1 周后，根據(jù)體重隨機分成5 組，每組15 只小鼠。分別為空白對照組、模型組、植物乳桿菌Zhang-LL 低劑量組、植物乳桿菌Zhang-LL 高劑量組、植物乳桿菌Zhang-LL 上清組。

表1 灌喂方法Table 1 The method of feeding

1.2.3 實驗動物的檢測指標

1）小鼠體重及一般情況 試驗期間，定時更換墊料，保持飲食飲水條件正常。每天稱重飼料剩余質(zhì)量、飼料添加質(zhì)量、剩余水量、添加水量。通過這些數(shù)據(jù)計算出每籠小鼠日進食量、攝水量，觀察小鼠外觀、行為、傷亡等情況，每周定期集中給每只小鼠稱重1 次。

2）小鼠血清及器官采取 血清：12 周末小鼠禁食不禁水12 h 后稱重并眼球采血，室溫凝固1 h 后3 500 r/min，15 min 離心后置于-20～-70 ℃低溫貯藏待用。使用全自動生化分析儀測定小鼠血清的總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）指標，使用試劑盒測定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（南京建成，貨號C010-2-1）、小鼠血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（南京建成，貨號C009-2-1）。

臟器：斷頸處死小鼠后立刻采集小腸、肝臟等，4 ℃生理鹽水漂洗后濾紙拭干，稱重器官后液氮保存。臟器指數(shù)的計算方法為內(nèi)臟質(zhì)量/大鼠體重×100%。

3）小鼠肝勻漿制備 解剖后采集小鼠肝臟右葉組織，鹽水漂洗濾紙擦干稱重后剪成碎塊，加入9 倍組織體積的生理鹽水（4 ℃），并于玻璃勻漿管勻漿化處理，制備成10%肝勻漿，3 000 g，離心15 min，留上清液待用。肝勻漿-20～-70 ℃低溫保藏[19]。

4）小鼠肝臟勻漿指標的測定 肝臟勻漿中AST 和ALT 活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA） 含量及還原性谷胱甘肽（GSH）含量的測定，使用南京建成生物研究所相應試劑盒進行測定。

5）肝臟病理切片制作 將肝臟組織于10%的中性福爾馬林溶液中固定4～6 h；再用85%乙醇溶液浸泡90 min，95%乙醇40 min 2 次，無水乙醇45 min 3 次，二甲苯10 min 2 次；于54～56 ℃石蠟中浸泡30 min 2 次；用82 ℃硬蠟+蜂蠟包埋，室溫保存；用切片機制備4 μm 厚切片；70 ℃烤箱烘烤45 min；最后HE 染色并進行顯微鏡讀片[20]。

6）腸道切片制作 取2 cm 小腸組織，生理鹽水沖洗后放入福爾馬林溶液固定。經(jīng)修塊水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、透明、封固等步驟，制成厚5 μm 的HE 染色組織切片，顯微鏡下觀察小腸絨毛形態(tài)[21]。

7）小鼠腸通透性測定 取10 cm 源于KHBB 緩沖液（pH 7.4）的新鮮回腸組織，結(jié)扎線結(jié)扎一端，灌胃針從另一端注入100 μL FITCdextran 溶液后將另一端結(jié)扎，形成8 cm 的腸管。將其置于2 mL 的KHBB 液體，37 ℃恒溫箱孵化20 min。熒光分光光度法激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm 測定腸管中滲透至孵化緩沖液中的FD-4 溶液。測定每分鐘每厘米小腸FD-4 滲透量，得到小腸的通透性數(shù)據(jù)[22]。

8）小鼠腸道菌群分析 根據(jù)文獻中報道方法提取小鼠糞便基因組[17]，利用二/三代測序平臺，對16S rDNA 功能基因等特定區(qū)段PCR 產(chǎn)物進行高通量測序，獲得腸道樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及與環(huán)境相關(guān)性等信息。本研究由美吉生物公司對樣本進行測序，并通過I-Sanger 云平臺進行分析。通過門水平、屬水平上腸道菌群的改變來分析各試驗組菌群結(jié)構(gòu)的變化，并進行相似性聚類分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件選用Duncans法進行單因素方差分析、顯著性分析，顯著性水平為P<0.05，指標結(jié)果為平均值±標準差（±s）。除動物試驗均做3 次重復試驗。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 實驗動物的一般情況

對照組小鼠皮毛光澤柔順、體態(tài)活潑、體重正常、反應靈敏、進食飲水正常、無嗜睡現(xiàn)象。模型組和植物乳桿菌各組小鼠從試驗第3 周灌胃酒精開始，出現(xiàn)皮毛粗糙無光、體態(tài)呆板、體重下降、反應遲緩、食欲減退、精神萎靡等癥狀，醉酒行為明顯，一般經(jīng)2～3 h 后可緩解。較于模型組，植物乳桿菌各組小鼠醉酒癥狀輕，醒酒時間短；但與對照組小鼠相比，植物乳桿菌干預各組小鼠體態(tài)消瘦、食欲欠佳、持續(xù)死亡。總體來看，植物乳桿菌各組小鼠情況劣于對照組，優(yōu)于模型組。

2.2 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠體重的影響

酒精對消化系統(tǒng)的刺激破壞，會降低動物的消化能力使其體重降低。植物乳桿菌通過磷壁酸與腸黏膜上皮細胞結(jié)合形成生理屏障，減少來自酒精的損傷[11，18]。研究結(jié)果顯示所有分組小鼠體重在第0 到2 周適應期內(nèi)呈明顯逐漸上升的趨勢，從第3 周起給各組加灌生理鹽水或酒精，對照組小鼠體重呈上升趨勢且一直為同一時期各組中最大值。模型組小鼠則體重增長緩慢，體重一直處于同時期各試驗組中的最小值（圖1a）。體重指標表明，長期攝入酒精已經(jīng)顯著影響小鼠的正常生長，體重增加減緩。從12 周的體重數(shù)據(jù)分析，模型組的小鼠體重顯著低于其它各試驗組，植物乳桿菌各干預組（低高劑量活細胞組及無細胞上清組）的小鼠體重沒有顯著性差異，與對照組也沒有顯著性差異，表明植物乳桿菌Zhang-LL 可以顯著緩解長期攝入酒精對機體生長的負面影響。在已有報道中，尚未發(fā)現(xiàn)正常食物飼喂情況下酒精攝入后會引起機體體重的顯著變化[11，23]，但本研究挑選第12 周作差異顯著性分析，結(jié)果顯示對照組與各植物乳桿菌Zhang-LL 干預組之間沒有顯著性差異，但均顯著高于模型組（P＜0.05）（圖1b）。試驗結(jié)果表明，植物乳桿菌Zhang-LL 的低、高劑量及其培養(yǎng)上清液均可以顯著緩解醉酒劑量攝入乙醇帶來的體重減輕的影響。

圖1 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠體重的影響Fig.1 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on the body weight of mice

2.3 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠食欲的影響

研究結(jié)果表明，長期攝入一定量的酒精會導致胃黏膜出血、潰爛，影響酶活性，減退動物食欲和消化能力，使機體代謝紊亂，影響進食[18]。本研究針對試驗周期內(nèi)各組小鼠的飼料攝入量及飲水量進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示模型組小鼠的飼料攝入量約為對照組（1888.0 g）的55.1%（P<0.05）（圖2a），飲水量為對照組（2 307.7 mL） 的51.6%（P<0.05）（圖2b），表明模型組小鼠體重降低可能由于進食量降低引起。另外，數(shù)據(jù)表明植物乳桿菌Zhang-LL 各干預組的飲水量為1 826.8～1 860.1 mL 顯著低于對照組，顯著高于模型組（圖2a）；但飼料攝入量為1 492.9～1 671.3 g，與對照組沒有顯著性差異，顯著高于模型組（圖2b）。數(shù)據(jù)結(jié)果表明植物乳桿菌Zheng-LL 可以顯著緩解醉酒劑量攝入乙醇給機體食欲帶來的負面影響，保持機體的正常食物攝入量。

圖2 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠飲食量的影響Fig.2 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on the diet amount of mice

2.4 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠血脂代謝的影響

慢性酒精損傷會增高血脂水平，使脂肪變性產(chǎn)生脂肪泡。酒精會阻礙體內(nèi)脂肪代謝，其代謝產(chǎn)物乙醛等抑制脂肪酸分解。這時，進入氧化代謝途徑的游離脂肪酸減少，TG 合成代謝途徑的增多，血清TG 水平上升[13，23]。由圖3a 可知，試驗周期結(jié)束時模型組血清中TG 含量并未發(fā)生顯著變化，與對照組沒有顯著性差異（P>0.05）。但植物乳桿菌高劑量組、上清組的血清TG 含量明顯降低，尤其是上清組的血清TG 含量顯著低于模型組，甚至顯著低于對照組（P＜0.05），表明植物乳桿菌Zhang-LL 的無細胞培養(yǎng)上清液具有影響機體脂質(zhì)代謝，減少TG 合成，降低血液中TG 的作用，甚至在酒精損傷情況下，依然具有顯著的作用效果。

低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）主要來自小腸和肝臟。LDL-c 將肝臟中膽固醇運輸?shù)狡渌M織器官，當血液膽固醇過量時，來自LDL-c 的膽固醇開始堵塞血管壁，減小血管內(nèi)徑，嚴重干擾機體生化代謝[13]。本研究結(jié)果顯示，試驗周期結(jié)束時，模型組血清中的LDL-c 的含量顯著高于對照組（P＜0.05），模型組較對照組升高了3 倍。而植物乳桿菌Zhang-LL 低劑量組較模型組降低了75%，高劑量組降低了50%，上清組降低了58.3%，3 組與對照組差異無顯著性（P＞0.05），均顯著低于模型組（圖3b），結(jié)果表明植物乳桿菌Zhang-LL 可以緩解酒精損傷增加機體低密度脂蛋白積累的負面影響。

圖3 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠血清甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的影響Fig.3 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on triglycerides and low density lipoprotein cholestero in mice serum

還原型谷胱甘肽（GSH）由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成，是一種低分子清除劑。它通過巰基與自由基結(jié)合，清除O2-，H2O2，加速自由基排出。它增強含琉基酶穩(wěn)定性，防止血紅蛋白和其它輔因子氧化損傷，GSH 水平用來衡量機體抗氧化能力，是肝臟受損傷程度的指標[18，24]。如圖4所示，模型組<對照組<植物乳桿菌Zhang-LL 上清組<植物乳桿菌Zhang-LL 低劑量組<植物乳桿菌Zhang-LL 高劑量組，植物乳桿菌Zhang-LL 高劑量組、低劑量組、上清組GSH 含量是模型組1.77 倍、3.23倍、1.6 倍，模型組小鼠肝臟勻漿GSH 水平與植物乳桿菌Zhang-LL 各組差異均有顯著性（P＜0.05），對照組與植物乳桿菌Zhang-LL 高劑量組、低劑量組差異均有顯著性。這說明植物乳桿菌Zhang-LL可明顯提高鼠肝臟勻漿GSH 水平，提升機體抵御氧化損傷的能力。

圖4 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠肝臟谷胱甘肽含量的影響Fig.4 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on glutathione content in mice liver

2.5 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠腸道功能的影響

2.5.1 對小腸組織的影響 小腸是動物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，其功能性依賴于正常黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。小腸黏膜上皮的皺襞、絨毛、微絨毛等特殊結(jié)構(gòu)擴大了其吸收養(yǎng)分的表面積，其中小腸絨毛作為小腸黏膜主要結(jié)構(gòu)，是衡量小腸吸收功能重要指標，酒精會影響小腸絨毛形態(tài)[10，22]。通過觀察圖5小腸絨毛組織切片可知，對照組小腸絨毛致密完整，長且寬；模型組絨毛密度稀疏，明顯損傷脫落，短且窄；植物乳桿菌Zhang-LL 上清組小腸絨毛粗壯致密，高度較對照組高。本研究認為植物乳桿菌Zhang-LL 上清液在消除酒精對小腸絨毛的損傷作用的基礎上還能促進其生長。

圖5 小鼠小腸絨毛HE 染色Fig.5 HE staining of mice small intestinal villi

2.5.2 對小鼠小腸通透性的影響 腸黏膜通透性指某特定物質(zhì)在腸黏膜表面非易化擴散的滲透能力。腸道對大分子物質(zhì)通透性增加說明腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能有腸道內(nèi)細菌或內(nèi)毒素滲漏，通過腸道屏障進入血液循環(huán)。本研究用腸道對大分子物質(zhì)通透性來評估腸道黏膜屏障功能[22，25]。大量研究顯示，長期攝入酒精可損傷腸道，增加腸通透性，延遲腸道上皮細胞遷移更新，嚴重時會導致克羅恩病、糖尿病、乳糜瀉、腸易激綜合征（IBS）、特異性皮炎等疾病[14，22]。由圖6可知，試驗周期結(jié)束時，模型組的小腸通透性與對照組相比并未產(chǎn)生顯著性變化，但植物乳桿菌Zhang-LL 的高劑量組及上清組可以顯著降低小腸的通透性，尤其是上清組，小腸通透性已經(jīng)顯著低于對照組。吳思琪等對植物乳桿菌Zhang-LL 預防腸炎機理研究的結(jié)果表明，植物乳桿菌Zhang-LL 可以顯著提高腸道組織中緊密連接蛋白表達量，從而降低腸道的通透性，阻擋腸道內(nèi)部毒素等物質(zhì)滲透到血液中，緩解腸炎癥狀[11，17，22]。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似，表明植物乳桿菌Zhang-LL 的確有降低腸道通透性的作用效果，維持腸道絨毛的完整狀態(tài)，從而減少不利機體健康物質(zhì)滲入血液，保持機體的腸道健康功能。

圖6 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠小腸通透性的影響Fig.6 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on intestinal permeability of mice

2.6 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

利用Illumina 高通量測序平臺分析不同乳酸菌菌株對因長期酒精攝入改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。初步分析結(jié)果表明：長期攝入酒精顯著改變小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，外源攝入植物乳桿菌菌株Zhang-LL 后小鼠的菌群結(jié)構(gòu)與對照組小鼠及模型組小鼠的差異具有顯著性（圖7a），但相對于模型組，對照組與Zhang-LL 菌株各受試組小鼠菌群結(jié)構(gòu)有更接近的相似性（圖7b）。表明植物乳桿菌Zhang-LL 可以顯著緩解由于長期攝入酒精引起的腸道菌群紊亂。

圖7 植物乳桿菌菌株Zhang-LL 各組受試物組的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性樹狀圖Fig.7 The tree of structural similarity of the intestinal microflora of mice in the Lactobacillus plantarum Zhang-LL test groups

2.7 植物乳桿菌Zhang-LL 對小鼠其它指標的影響

除上述指標外，本研究還觀察了各組試驗小鼠肝臟組織病理切片，檢測了肝臟、脾臟及腎臟的臟器指數(shù)，以及血清及肝臟組織中的ALT、AST 酶活、MDA 含量以及GSH-Px 酶活，但模型組、各干預組及對照組之間的這些指標均未出現(xiàn)顯著性差異，推測為期12 周的酒精灌胃試驗影響了小鼠與機體健康相關(guān)的部分指數(shù)，但對肝臟并未產(chǎn)生病理性的改變。有研究報道顯示，10～14 mL/kg/d 的48%或60%的乙醇灌胃量會導致小鼠發(fā)生顯著的醉酒行為學表現(xiàn)[26-27]。本研究中灌胃劑量的后8 周的50%的灌胃劑量為5.7～7.1 mL/kg/d（約0.2～0.25 mL/d/只），少于文獻報道中的醉酒劑量，然而小鼠已出現(xiàn)醉酒行為，結(jié)果表明，在試驗周期內(nèi)，雖然持續(xù)以使小鼠出現(xiàn)醉酒的劑量進行灌胃，但是未使小鼠的肝臟出現(xiàn)病理性改變。

3 結(jié)論

植物乳桿菌Zhang-LL 干預可以顯著緩解酒精損傷引起攝食量減少及體重增長減緩的負面影響（P<0.05）。與模型組相比，植物乳桿菌Zhang-LL培養(yǎng)上清液還可以顯著降低酒精損傷的小鼠血清中TG 及LDL-c 的水平，增加肝臟組織中GSH 的含量，降低腸道通透性，保持小腸絨毛的完整性，平衡腸道菌群結(jié)構(gòu)（P<0.05）。在試驗周期內(nèi)，攝入酒精小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)酒精損傷的病理性改變，組織及血液中ALT 酶活、AST 酶活，組織中MDA 含量及GSH-Px 酶活均沒有顯著變化，植物乳桿菌Zhang-LL 各干預組對這些指標也沒有顯著影響（P>0.05）?？傮w來看，植物乳桿菌Zhang-LL 對酒精攝入給機體帶來的部分負面影響具有顯著的改善作用，尤其以植物乳桿菌Zhang-LL 培養(yǎng)上清液作用效果最為顯著。