趙改名,李珊珊,崔文明,祝超智*,王晗,銀峰,焦陽(yáng)陽(yáng),李佳麒,韓明山

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州,450002)2(通遼綜合實(shí)驗(yàn)站,內(nèi)蒙古 通遼,028000)

臘肉主要是以畜肉為原料,經(jīng)過(guò)腌制、烘干(風(fēng)干)等加工工藝制成的肉制品,從廣義上講也屬于低酸發(fā)酵肉制品(pH≥5.5)[1],具有風(fēng)味濃郁、耐貯藏、方便食用等特點(diǎn),深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但目前臘肉生產(chǎn)過(guò)程中仍面臨一些問(wèn)題:生產(chǎn)工藝落后、周期長(zhǎng)、成本較高；自然發(fā)酵過(guò)程中易受雜菌的污染,從而導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定且不可控[2-3]。因此,使臘肉加工實(shí)現(xiàn)工業(yè)化已成為必然趨勢(shì)。近幾年,企業(yè)采用快速腌制和高溫烘烤的工藝,大幅度縮短了生產(chǎn)周期、并使衛(wèi)生狀況得以改善,但因成熟期較短,且采用高溫烘干的方式,加速了脂肪的氧化,并缺失了微生物發(fā)酵對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的貢獻(xiàn),致使最終產(chǎn)品與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的臘肉相比,仍存在一定的差距[4]。

傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉通常會(huì)有來(lái)自原料以及生產(chǎn)環(huán)境中存在的微生物,而細(xì)菌是參與發(fā)酵的主要微生物,因此,了解臘肉中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成是調(diào)控和提升產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。目前關(guān)于臘肉中微生物的報(bào)道較多,但多數(shù)研究對(duì)以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的微生物學(xué)手段進(jìn)行分析,該方法的缺陷是不能全面、準(zhǔn)確地反映樣品的微生物信息[5]。高通量測(cè)序技術(shù)是目前研究微生物多樣性中應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù),不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性,還能檢測(cè)到低存在率以及不可培養(yǎng)的微生物[6],目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酸奶[7]、泡菜[8]、白酒[9]、醋[10]等生物群落結(jié)構(gòu)研究。

本研究以來(lái)源于湖北、云南、重慶、貴州、河南的傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉為研究對(duì)象,采用 Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序,更全面地呈現(xiàn)臘肉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性；同時(shí)結(jié)合電子鼻分析,探究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與臘肉風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)系,以期為傳統(tǒng)臘肉的生產(chǎn)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年3月在湖北(HB)、云南(YN)、重慶(CQ)、貴州(GZ)、河南(HN)5個(gè)地區(qū)分別購(gòu)買當(dāng)?shù)剞r(nóng)家自制臘肉,樣品均為2019年1月左右制作,使用采樣袋在常溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,保存在-40 ℃?zhèn)溆?采用信息見(jiàn)表1。

表1 采樣信息

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,北京天根生物科技有限公司；Taq酶、引物等,上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD無(wú)菌操作臺(tái),美國(guó)Airtech公司；TGradient梯度PCR儀,德國(guó)Biometra公司；EC3-310凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)UVP公司；DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠；DHP—9272低溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；Easy MIX拍擊式均質(zhì)儀,梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；PEN3電子鼻,德國(guó)AIR-SENSE公司。

1.3 儀器與設(shè)備

1.3.1 樣品處理

在無(wú)菌條件下,將樣品剪碎,混勻后稱取25 g樣品裝入無(wú)菌的均質(zhì)袋中,加入 225 g 無(wú)菌生理鹽水,拍擊式均質(zhì)器拍打2 min提取細(xì)菌,均質(zhì)液采用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾,收集濾液,濾液裝入無(wú)菌的離心管中,在4 ℃、2 000 r/min下離心5 min,取離心后的上清液放入另外的無(wú)菌離心管中,在4 ℃、9 500 r/min下離心10 min,棄去上清液,即為菌體沉淀。每個(gè)樣品做3次平行處理。

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

按照細(xì)菌DNA 試劑盒使用說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA。用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95 ℃ 變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系:20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化,Tris-HCl進(jìn)行洗脫,2%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光劑檢測(cè)定量。根據(jù) Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4 電子鼻測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]和[12]的方法,略有改動(dòng)。將臘肉絞碎,稱取15 g肉樣放入250 mL的錐形瓶中,用3層保鮮膜密封,40 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min后立即測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：頂空進(jìn)樣,清洗時(shí)間60 s,傳感器歸零時(shí)間5 s,樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s,數(shù)據(jù)采集時(shí)間80 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品做3 次重復(fù)試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。測(cè)序序列使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用RDPclassifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)。利用生物云平臺(tái)(www.i-sanger.com)、R語(yǔ)言作圖工具等繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等。利用Origin 2017繪制揮發(fā)性物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度和相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源臘肉樣品測(cè)序深度和OTU分析

采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序獲得了5個(gè)來(lái)源臘肉樣品的原始序列數(shù)據(jù),15個(gè)樣本經(jīng)Trimmomatic及FLASH軟件優(yōu)化后,共得到了636 675條有效序列。稀釋曲線是根據(jù)序列條數(shù)和測(cè)序深度與其所聚類得到OTU數(shù)(97%相似性)進(jìn)行繪制得到。由圖1-a可知,在樣品量大于30 000時(shí),樣品的稀釋曲線逐漸趨于平坦,說(shuō)明各樣品測(cè)序數(shù)量較為充分合理,符合后續(xù)的生物信息學(xué)分析要求。OTU數(shù)可以反映樣品中細(xì)菌的豐度,對(duì)樣品進(jìn)行OTU聚類分析,共獲得的OTU數(shù)量為258個(gè),涵蓋了7門、10綱、33目、56科、83屬。不同來(lái)源樣品中OTU數(shù)目存在差異,其中HB樣品中包含的OTU數(shù)目最多(238個(gè)),特有的OTU數(shù)目也最多(165個(gè)),說(shuō)明所含有的細(xì)菌種類及特有的細(xì)菌種類均最多；CQ和YN樣品的OTU數(shù)較為接近,分別為62和57,特有的OTU數(shù)目分別為5和4；GZ樣品中包含的OTU數(shù)目最少(28個(gè)),無(wú)特有的OTU種類。除HB樣品外,其他4個(gè)樣品特有的OTU數(shù)所占比例均<10.81%,說(shuō)明雖然臘肉來(lái)源不同,但大多數(shù)樣品的細(xì)菌多樣性特異性較小,相似性較高。

a-稀釋曲線；b-Venn圖

2.2 不同來(lái)源臘肉樣品的Alpha多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息,采用Alpha多樣性指標(biāo)中的Shannon、ACE、Chao1及Coverage指數(shù)對(duì)樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度進(jìn)行評(píng)估。由表2可知,各樣品的Coverage指數(shù)均達(dá)到了0.99以上,說(shuō)明樣品文庫(kù)中序列基本上都被測(cè)出,即樣本測(cè)序結(jié)果可以反應(yīng)樣品真實(shí)情況,測(cè)序結(jié)果合理。HB樣品的ACE、Chao1指數(shù)均最高,說(shuō)明該樣本中物種豐富度最高；CQ樣品中Shannon指數(shù)最高,ACE、Chao1指數(shù)僅次于HB樣品,說(shuō)明其微生物多樣性最高,物種豐富度也較高；GZ樣品中ACE、Chao1及Shannon指數(shù)均為最低,說(shuō)明樣品中的細(xì)菌豐富度和多樣性都最低,這與OTU分析結(jié)果一致(圖1)。

表2 Alpha多樣性指數(shù)

2.3 不同來(lái)源臘肉樣品中的細(xì)菌群落組成分析

2.3.1 基于門分類水平的分析

5個(gè)來(lái)源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉樣本序列經(jīng)RDP classifier軟件進(jìn)行分類分析,在門水平上,共檢測(cè)到7個(gè)細(xì)菌門,其樣本群落組成如圖2所示。不同來(lái)源樣品中共有的細(xì)菌門有3個(gè),分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria),其中Proteobacteria和Firmicutes為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門,兩者的相對(duì)豐度達(dá)到98%以上。這與多數(shù)研究一致,在風(fēng)干肉[11]、發(fā)酵香腸[13]、腐乳[14]等多種傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中,均發(fā)現(xiàn)Proteobacteria和Firmicutes為優(yōu)勢(shì)菌門。HB、GZ、HN、CQ樣品中的第1優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes,相對(duì)豐度分別高達(dá)59.59%、88.28%、80.64%、85.98%；第2優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門Proteobacteria,相對(duì)豐度分別為39.40%、11.70%、19.29%、13.87%。而YN樣品中的第1優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Proteobacteria,相對(duì)豐度為64.66%；第2優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為Firmicutes,相對(duì)豐度為35.05%。Actinobacteria在各樣品中相對(duì)豐度較少,比例為0.01%～0.13%。

圖2 門水平物種分布柱狀圖

此外,除GZ樣品外,其他樣品均含有unclassified_k_norank_d_Bacteria。HB和CQ樣品還包含極少量的擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍(lán)菌門(Cyanobacteria),相對(duì)豐度分別為0.07%、0.01%和0.08%、0.02%。

2.3.2 基于屬分類水平的分析

5個(gè)來(lái)源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中共鑒定出83個(gè)細(xì)菌屬,圖3顯示了主要優(yōu)勢(shì)菌屬(前15位)的分布情況。前15個(gè)屬中,HB和CQ樣品所包含的屬種類最多,均為14個(gè)屬,YN樣品包含13個(gè)屬,HN樣品包含11個(gè)屬,GZ樣品中包含的屬種類最少,為10個(gè)屬,這與Alpha多樣性分析結(jié)果一致(表2)。5個(gè)來(lái)源樣品中共有的屬包括葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、環(huán)絲菌(Brochothrix)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)和未識(shí)別的芽孢桿菌(unclassified_c_Bacilli)。以相對(duì)豐度>10% 統(tǒng)計(jì),CQ樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus(32.43%)、Staphylococcus(31.93%)、Weissella(14.07%)、Psychrobacter(13.37%)；YN樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Psychrobacter(63.80%)、Brochothrix(20.76%)；HN、GZ、HB樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均為Staphylococcus和Psychrobacter,所占比例分別為79.72%、86.30%、48.71% 和15.69%、11.70%、38.05%。除YN樣品外,Staphylococcus和Psychrobacter均為樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。GZ和HN樣品中Staphylococcus和Psychrobacter所占的比例分別高達(dá)98.00%和95.41%,其他菌屬所占比例較低且菌種多樣性較差,這與樣品多樣性分析一致(表2)。樣品中還檢測(cè)到乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)等,Lactococcus和Leuconostoc在YN樣品中相對(duì)豐度最高,分別為3.41%和3.58%,在其他樣品中的相對(duì)豐度均<2%。此外,在HN樣品中檢測(cè)出Cobetia；在CQ、HB樣品中檢測(cè)出Aerococcus；在超過(guò)3個(gè)地區(qū)樣品中檢測(cè)出unclassified_c_Bacilli、Carnobacterium和Acinetobacter,柱狀圖中未顯示的并不代表該樣品中無(wú)此菌屬,可能是因?yàn)樗急壤^小(<0.5%),歸類為others。

圖3 屬水平物種分布柱狀圖

乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococcus,CNS)被認(rèn)為是發(fā)酵肉制品成熟過(guò)程中的2種主要微生物,對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)特性有至關(guān)重要的影響[15-16]。葡萄球菌中的木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)等具有較強(qiáng)的蛋白酶和脂肪酶活性,有利于產(chǎn)生多肽、游離氨基酸和游離脂肪酸,對(duì)發(fā)酵肉制品的質(zhì)地和風(fēng)味起關(guān)鍵作用[17],并有研究表明,S.xylosus和S.carnosus具有硝酸鹽還原酶活性,可以有效促進(jìn)發(fā)酵肉制品的發(fā)色作用。清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosus)等一般都具有較好的產(chǎn)酸能力,能抑制部分有害微生物的生長(zhǎng),甚至具有抗氧化、降低膽固醇等功能性作用[18]。Weissella作為乳酸菌的一種,也具有提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量、縮短發(fā)酵周期等重要作用[19]。

作為參與肉制品發(fā)酵的菌種,乳酸菌被認(rèn)為是安全的,但對(duì)于其他菌種,對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的影響有待進(jìn)一步研究。Psychrobacter在各樣品中均為優(yōu)勢(shì)菌屬,相對(duì)豐度為11.70%～63.80%。相關(guān)研究報(bào)道,Psychrobacter屬于低溫冷藏食品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[20-22],能夠引起產(chǎn)品產(chǎn)生輕微腥味和發(fā)霉的氣味[23-24]。在多種發(fā)酵肉制品[25]中也檢測(cè)出Psychrobacter,若發(fā)酵完成的產(chǎn)品在冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)和脂肪繼續(xù)被分解,會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)。Brochothrix均存在于5個(gè)來(lái)源樣品中,相對(duì)豐度為0.06%～20.76%,該菌能夠在好氧和厭氧條件下生長(zhǎng),被認(rèn)為是使肉類產(chǎn)生異味和肉類腐敗的因素之一[26-27]。除HB樣品外,在其他4個(gè)地區(qū)樣品中均檢測(cè)到Carnobacterium,相對(duì)豐度為0.02%～0.82%,有研究表明Carnobacterium是低溫冷藏小龍蝦中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌,同時(shí),也有報(bào)道稱Carnobacterium參與不飽和脂肪酸的代謝,從而促進(jìn)了酸價(jià)、過(guò)氧化值上升。在YN、CQ、HB這3個(gè)地區(qū)樣品中檢測(cè)到Acinetobacter,該菌種在發(fā)酵產(chǎn)品中較為常見(jiàn),雖然在臘肉細(xì)菌群落中相對(duì)豐度較小(HB樣品中相對(duì)含量為0.83%、CQ和YN樣品中均為0.01%),但會(huì)使產(chǎn)品產(chǎn)生異味和腐敗,并且作為條件性致病菌,應(yīng)注意其潛在危險(xiǎn)性。在YN、GZ、CQ 3個(gè)地區(qū)樣品中檢測(cè)到unclassified_c_Bacilli,相對(duì)豐度為0.03%～1.93%,該類菌會(huì)產(chǎn)芽孢且耐高溫,部分芽孢桿菌可能還會(huì)產(chǎn)生毒素,危害人體健康。CQ、HB樣品中檢測(cè)到Aerococcus,相對(duì)豐度分別為0.02%和2.87%,該菌屬于革蘭氏陽(yáng)性球菌,對(duì)食鹽和膽鹽有一定的耐受性,但目前有研究報(bào)道一些疾病的產(chǎn)生與Aerococcus屬中的一些菌有關(guān)[28-29],應(yīng)注意該菌種在發(fā)酵肉制品中的潛在危害。多數(shù)地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)原料肉不做殺菌處理,衛(wèi)生質(zhì)量主要依靠原料肉自身和周邊的環(huán)境條件,容易被致病菌或腐敗菌污染。因此,發(fā)酵肉制品因被致病菌或腐敗菌污染而引起的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)該被廣泛關(guān)注。雖然不同來(lái)源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉的原料、加工工藝和環(huán)境條件等不盡相同,但Psychrobacter、Brochothrix、Carnobacterium、Aerococcus、Bacilli和Acinetobacter在多個(gè)地區(qū)產(chǎn)品中出現(xiàn),對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)品安全性存在潛在威脅。關(guān)于產(chǎn)品的安全性,可以通過(guò)使用發(fā)酵劑代替自然發(fā)酵,規(guī)范加工生產(chǎn)工藝,保證產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性。

2.4 不同來(lái)源臘肉樣品中細(xì)菌群落比較

主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)是結(jié)合聚類分析與主成分分析的方法,用較少的主坐標(biāo)對(duì)分類單元進(jìn)行有效地排序,樣本組成越相似反映在PCoA圖中的距離越近[11]。如圖4-a所示,主成分1和主成分2分別解釋了不同來(lái)源臘肉樣品中細(xì)菌群落 62.68%和 23.28%的信息,2個(gè)主成分所占比例之和超過(guò)85%,表明這2個(gè)成分能較好地代表樣品中的細(xì)菌群落信息。同一來(lái)源的樣品在主坐標(biāo)分析圖中比較聚集,說(shuō)明樣品測(cè)序結(jié)果重復(fù)性較好。在主成分1水平上,YN、HB樣品與GZ、HN、CQ樣品能較好地區(qū)分；GZ和HN樣品距離最近,甚至出現(xiàn)交叉重疊現(xiàn)象,差異不大,這與Heatmap中聚類結(jié)果一致(圖4-b),說(shuō)明GZ和HN來(lái)源的樣品中細(xì)菌群落較為相似。YN樣品與HN、GZ樣品在圖4-a中距離較遠(yuǎn),說(shuō)明細(xì)菌群落差異較大。不同來(lái)源臘肉的原料、加工工藝和環(huán)境條件等都可能導(dǎo)致樣品中細(xì)菌群落的差異,從而導(dǎo)致樣品風(fēng)味等品質(zhì)的差異性。

圖4 細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析圖(a)和屬水平Heatmap(b)

2.5 不同來(lái)源臘肉樣品中的菌群結(jié)構(gòu)與產(chǎn)品風(fēng)味

使用電子鼻技術(shù)對(duì)不同來(lái)源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由圖5可知,電子鼻10個(gè)傳感器對(duì)臘肉樣品中的風(fēng)味物質(zhì)均有很好的響應(yīng)。不同地區(qū)樣品對(duì)電子鼻傳感器的響應(yīng)值存在顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明不同樣品的風(fēng)味存在一定差異。W5S和W1W傳感器的響應(yīng)值相對(duì)最高,W1S和W2S的響應(yīng)值次之,W1C和W3C的響應(yīng)值最低。GZ和HN樣品的傳感器響應(yīng)值有50%不存在顯著性差異(P>0.05),而YN與GZ樣品和YN與HN樣品的傳感器響應(yīng)值分別有70%和90%存在顯著性差異(P<0.05)。這可能與GZ和HN樣品的群落相似性較高,而YN樣品與GZ、HN樣品相似性較低有關(guān)(圖4)。

圖5 不同來(lái)源臘肉中揮發(fā)性物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度

對(duì)平均相對(duì)含量>1.00%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6所示,Psychrobacter和Brochothrix菌株均與W5S、W1W、W2W顯著正相關(guān)(P<0.05),而W1W和W2W代表傳感器對(duì)硫化物較為敏感,W5S代表對(duì)氮氧化合物較為敏感。孫娜等[30]的研究中表明,一些硫化物呈現(xiàn)的氣味描述為腐臭味和惡臭味等不良風(fēng)味,這與之前的研究和前文中推測(cè)相符,說(shuō)明Psychrobacter和Brochothrix可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面的影響。揮發(fā)性物質(zhì)與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系復(fù)雜,某一種揮發(fā)性成分可能與多種細(xì)菌菌群均存在一定的相關(guān)性,可能是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。如W1W和W2W還與Staphylococcus存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05),這可能是因?yàn)槠咸亚蚓鷮僦胁糠志昃哂邢跛猁}還原和抗氧化能力,可以阻止不飽和脂肪酸的氧化和其他不良風(fēng)味的形成。另外,Staphylococcus與W1C、W3C、W5C有較高的正相關(guān)關(guān)系,而W1C、W3C、W5C主要對(duì)芳香類物質(zhì)敏感,說(shuō)明葡萄球菌對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成發(fā)揮著重要作用。周慧敏等[4]研究發(fā)現(xiàn)添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌可以有效促進(jìn)氨基酸代謝類風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生,同時(shí)可以降低脂質(zhì)氧化類物質(zhì)的形成速率。BECK等[31]研究中表明木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌能夠轉(zhuǎn)換氨基酸和游離脂肪酸,從而協(xié)調(diào)風(fēng)味的形成。Lactobacillus和Weissella與W1S、W2S和W3S均有正相關(guān)關(guān)系,而W1S、W2S和W3S代表的傳感器主要對(duì)烷類、醇類和酯類敏感。這與孫娜等[30]的研究結(jié)果相似,均表明乳桿菌等乳酸菌與醇類、酯類具有較高的相關(guān)性。這可能是因?yàn)槿樗峋鷮?duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味的貢獻(xiàn)主要是通過(guò)分解代謝碳水化合物、氨基酸等產(chǎn)生有機(jī)酸[32-33],且異型發(fā)酵的乳酸菌對(duì)碳水化合物的代謝和脂質(zhì)氧化可產(chǎn)生并不斷積累醇類物質(zhì),是形成酯類及其他香味成分的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[34]。原料肉中的肌原纖維和肌漿蛋白會(huì)經(jīng)過(guò)內(nèi)源酶或乳酸菌胞外酶的作用降解生成呈味氨基酸或寡肽,氨基酸進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)、氧化脫氨、脫羧反應(yīng)以及降解反應(yīng)形成其他物質(zhì),其中醛類物質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生氧化還原反應(yīng)形成酸類、醇類、酯類[35]。這都會(huì)直接或間接引起乳酸菌與醇類、酯類等的相關(guān)性。

圖6 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與風(fēng)味指標(biāo)相關(guān)性

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析,同時(shí)結(jié)合電子鼻技術(shù)對(duì)風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示不同來(lái)源臘肉樣品在細(xì)菌組成方面存在較高的相似性。厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門；葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、環(huán)絲菌屬(Brochothrix)和魏斯氏菌屬(Weissella)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。葡萄球菌屬(Staphylococcus)可能會(huì)促進(jìn)產(chǎn)品中芳香類物質(zhì)的產(chǎn)生且抑制不良風(fēng)味；乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)可能影響臘肉中醇類、酯類和烷類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和環(huán)絲菌屬(Brochothrix)可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)變差,同時(shí)引起不良風(fēng)味的產(chǎn)生；在非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中,肉食桿菌屬(Carnobacterium)、氣球菌屬(Aerococcus)、芽孢桿菌屬(Bacilli)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)也有對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成不良影響的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果為深入了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵臘肉的微生物群落與產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系、開(kāi)發(fā)專用細(xì)菌發(fā)酵劑提供數(shù)據(jù)支撐和參考依據(jù)。