藍素桂,李治蓉,蘇愛秋,彭燕鴻,廖燕科,劉雪梅,譚強

(廣西中醫(yī)藥大學 藥學院,廣西 南寧,530200)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為革蘭氏陽性菌,廣泛分布于自然界、動物和人的體表以及與外界相通的腔道中(如鼻腔等)[1],是醫(yī)院內和社區(qū)感染的重要病原菌之一[2]。常見的S.aureus感染性疾病如毛囊炎、癤瘡、膿皰、乳腺炎、傷口感染和葡萄球菌燙傷皮膚綜合征等,而更嚴重的感染性疾病如菌血癥、肺炎、心內膜炎、骨和關節(jié)感染以及中毒性休克綜合征等[3]。前抗生素時代S.aureus菌血癥患者的致死率超過80%[4]。20世紀40年代初,青霉素的發(fā)現極大地改善了S.aureus感染性疾病預后情況,但隨著青霉素的廣泛使用,出現了青霉素耐藥菌株[5]。這些耐藥菌株產生青霉素酶可水解青霉素β泛內酰胺環(huán),導致青霉素失去活性。

耐藥菌是指在長期的抗生素選擇之后出現對相應抗生素產生耐受能力的菌株。細菌耐藥性是指細菌多次與藥物接觸后,對藥物的敏感性減小甚至消失,致使藥物對耐藥菌的療效降低甚至無效。耐藥菌株的出現增加了感染性疾病治愈的難度。耐青霉素酶的半合成青霉素甲氧西林于1959年應用于臨床,到1961年JEVONS便首次發(fā)現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)[6]。MRSA感染從發(fā)現至今幾乎遍及全球,易感人群也遍及所有年齡段[7]。

為解決不斷出現的耐藥性問題,科學家們對新型抗菌藥物投入大量的研究,四環(huán)素、頭孢菌素和其他天然的、半合成的和合成的抗菌素相繼被開發(fā)出來[8]。而在大多數常見S.aureus感染性疾病發(fā)病率和死亡率得到降低的同時,出現十分嚴重的S.aureus抗生素耐藥問題。根據ATLAS平臺(https://atlas-surveillance.com/#/login)的抗生素耐藥監(jiān)測數據,總結分析2005～2018年全球S.aureus對抗生素產生耐藥情況(表1),S.aureus幾乎對所有抗生素都產生了不同程度的耐藥性,這正是全球所面臨的抗生素耐藥的現狀。

表1 2005—2018年全球S.aureus對抗生素的耐藥情況

抗生素耐藥增加了臨床上S.aureus感染性疾病的治療難度和風險,增加了患者因長期住院而產生的巨大經濟負擔,同時也增加了全球的衛(wèi)生負擔。另外,抗生素耐藥也是S.aureus感染性疾病患者死亡率增加的重要原因。研究數據表明,在美國,超過80 000例侵入性感染和每年超過11 000例死亡是MRSA引起的[9-10]。預計到2050年,抗生素耐藥性將導致約3億人死亡,給全球經濟造成高達100萬億美元的損失[11]。

本文主要對S.aureus的抗生素耐藥機制、產生原因及對策進行綜述,為抗菌藥物的規(guī)范使用和減少抗生素耐藥的新藥研究提供理論指導,同時也為抗生素耐藥性應對策略的制定提供一些新的思路。

1 S.aureus抗生素耐藥機制研究

1.1 細胞壁相關的耐藥機制

S.aureus細胞壁主要由肽聚糖骨架、四肽側鏈和五肽交聯橋組成。對于敏感型S.aureus,抗生素通過特異性地與細胞壁合成過程中五肽末端的D-Ala-D-Ala殘基結合,阻礙S.aureus細胞壁合成過程中的轉糖基或(和)轉肽作用,抑制細胞壁合成,導致S.aureus無法生長或死亡,從而使抗生素發(fā)揮抗菌作用。而在耐藥S.aureus中,通過增加D-Ala-D-Ala殘基數量合成大量的肽聚糖,導致細胞壁增厚、形狀不規(guī)則。L-谷氨酰胺在五肽橋上的酰胺化作用減少,使肽聚糖鏈的交聯也減少,從而有更多的D-Ala-D-Ala殘基與抗生素結合,結合后的抗生素進一步阻礙藥物分子到達細胞膜上的作用靶點,最終形成對藥物的抵抗作用,如圖1-a所示[12-13]。此機制多見于S.aureus對糖肽類抗生素(如萬古霉素、替考拉寧等)的耐藥性。

a-細胞壁相關的耐藥機制；b-組蛋白傳導系統作用機制；c.-多藥外排泵；d-β-內酰胺酶的產生及其對青霉素的滅活過程

1.2 生物膜耐藥機制

細菌生物膜的形成是抗生素治療細菌感染性疾病失敗的主要原因[14]。細菌生物膜對抗生素的耐藥性通常是游離菌的10～1 000倍[15-16]。S.aureus生物膜的形成涉及到多種基因的表達和調控,S.aureus分泌的多糖胞間黏附素(polysaccharide intercellular adhesin,PIA)是其生物膜形成過程中細菌聚集階段必須的也是最重要因子,PIA 合成主要由ica操縱子編碼,具體包括icaR(調節(jié)基因)及串聯存在的icaA、icaD、icaB、icaC基因[17]。

S.aureus生物膜耐藥機制較復雜,且不同機制之間存在協同作用。分泌的胞外聚合物形成致密的天然屏障,阻礙抗生素向菌膜內部滲透,降低了菌膜內部藥物濃度。同時,菌膜中的滅活酶可水解進入的抗生素,使抗生素失活[18]。另外,被包裹在菌膜深層的S.aureus細胞代謝速率減慢甚至進入休眠狀態(tài),因此菌株對繁殖期殺菌劑的抗性也會增強[19]。

S.aureus生物膜耐藥機制及其相應的治療藥物在不斷的進行研究。近年來研究發(fā)現,組蛋白對S.aureus生物膜具有活性。如圖1-b所示[20],組蛋白與ApsS的負離子環(huán)結合,激活了編碼aps系統傳感器和調節(jié)蛋白的ApsS和apsR基因,vraFG轉運基因介導的aps調控抗性機制被激活,從而對S.aureus生物膜產生活性。這研究結果對開發(fā)針對耐藥菌株生物膜形式的抗菌藥物具有重要意義。

1.3 外排泵耐藥機制

外排泵也稱外排蛋白,是細菌將胞內的藥物或毒性物質排出胞外的蛋白轉運系統,在外排過程中需要進行質子交換或水解ATP提供能量,如圖1-c所示。外排泵耐藥機制是引起S.aureus對四環(huán)素類抗生素產生耐藥性的重要機制。外排泵的編碼基因位于染色體或質粒中,外排泵通過作用底物誘導編碼基因在耐藥菌中超表達。根據外排泵氨基酸序列的同源性可分為ATP結合盒超家族(ABC)、主要易化子超家族(MFS)、多藥及毒性化合物外排家族(MATE)、小多重耐藥家族(SMR)和耐藥節(jié)結化細胞分化家族(RND)。在S.aureus中,染色體或質粒編碼的外排泵超過15個(圖2)[2,21-22]。S.aureus對四環(huán)素類抗生素的耐藥主要由MFS家族外排蛋白負責。Tet蛋白是MFS中研究最清楚的蛋白,由tet基因負責編碼,可將四環(huán)素泵出胞外,降低了細胞內藥物濃度,從而保護了胞內的核糖體,導致S.aureus產生耐藥性[23-24]。

圖2 S.aureus四類多藥外排泵

1.4 產生滅活酶或鈍化酶耐藥機制

S.aureus可通過產生滅活酶或鈍化酶,破壞各種抗菌藥物(如四環(huán)素類、β-內酰胺類抗生素,包括半合成青霉素類和頭孢菌素類等)使其失去活性。目前主要發(fā)現的滅活酶或鈍化酶有β-內酰胺酶類、氨基糖苷類滅活酶、紅霉素類鈍化酶、氯霉素?；D移酶等。β-內酰胺酶的產生及其對青霉素的滅活過程如圖1-d所示[19],DNA結合蛋白Blal與操作區(qū)段結合,抑制了blaZ和blaR1-blal RNA的轉錄,在沒有青霉素的情況下,β-內酰胺酶的表達水平較低。當青霉素存在時,青霉素與跨膜傳感器BlaR1結合,刺激BlaR1自催化激活,激活的BlaR1直接或間接(通過另一種蛋白BlaR2)將Blal裂解成非活性片段,blaZ和BlaR1-Blal開始轉錄,導致青霉素的β-內酰胺環(huán)被blaZ編碼的β-內酰胺酶水解,青霉素失去活性[19]。

氨基糖苷類修飾酶的失活是S.aureus對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制。在氨基糖苷類修飾酶中,乙酰轉移酶(AAC)、磷酸轉移酶(APH)和核苷酸轉移酶(ANT)尤其是腺苷轉移酶是臨床重要的耐藥相關酶。AAC以乙酰輔酶A為供體,乙酰化氨基糖苷類藥物1,3,61,21位氨基,而APH和ANT均以ATP為供體,APH作用于氨基糖苷類藥物的31位—OH和4位(潮霉素)、311位和6位(鏈霉素)—OH,ANT作用于氨基糖苷類藥物211、41位—OH和311位、9位(大觀霉素)使之磷酸化,從而使氨基糖苷類藥物鈍化[25-27]。

1.5 代謝途徑、作用靶位改變耐藥機制

代謝途徑、作用靶點的改變也是S.aureus對抗生素常見的耐藥機制?？股刈饔冒形幻傅幕虬l(fā)生突變,會導致抗菌藥物的作用降低,如 β-內酰胺類抗菌藥物作用靶位改變。青霉素結合蛋白(PBPs)是細菌細胞膜的幾種蛋白質分子與青霉素結合形成的相對穩(wěn)定化合物,是β-內酰胺類抗生素的主要靶點。PBPs是細胞壁肽聚糖合成的必要酶,PBPs的改變是引起S.aureus對β-內酰胺類藥物產生耐藥性的主要原因。青霉素和頭孢菌素的結構與肽聚糖末端結構D-丙氨酰相似,可以競爭性地與酶的活性中心共價鍵結合,抑制黏肽轉肽酶所催化的交聯反應,破壞S.aureus細胞壁的形成,從而引起溶菌作用,導致細胞裂解死亡。當PBPs發(fā)生基因突變時,β-內酰胺類抗生素與其目標PBPs之間的親和力喪失,藥物無法與作用部位結合,從而導致S.aureus耐藥性的產生[28-29]。S.aureus對喹諾酮類抗生素主要耐藥機制也是作用靶位的改變。喹諾酮類藥物對S.aureus的主要作用靶點是DNA旋轉酶,當S.aureus長期與藥物接觸的過程中抗藥位點發(fā)生突變,降低了靶標(DNA旋轉酶和拓撲異構酶IV)對喹諾酮類藥物的親和力,從而產生耐藥[30]。該種耐藥機制對抗菌藥物特異性較差,使臨床有效藥物的選擇難度加大。

2 S.aureus抗生素耐藥產生原因分析

S.aureus耐藥菌株的產生既是自然選擇的結果,也是人為因素(如抗菌藥物的使用)作用強化的結果(圖3)。適者生存是自然界的法則,S.aureus勢必會朝著有利于自己生存的方向進化。但隨著抗菌藥物的使用,耐藥性變得越來越復雜。細菌獲得的抗性基因可以通過遺傳穩(wěn)定地傳遞給下一代,甚至可以通過水平基因轉移傳播給其他細菌[31]。

圖3 S.aureus自然選擇作用介導耐藥產生示意圖

2.1 自然選擇結果

影響自然選擇的因素有多種,比如細菌種群間的生存斗爭,細菌個體與群體之間的斗爭以及生存環(huán)境的斗爭,包括陽光(紫外線等)、本身就具有良好殺菌或抑制微生物功能的物質(如部分帶有特定基團的有機化合物、一些無機金屬材料及其化合物、部分礦物質等)和天然抗生素(微生物分泌代謝產物)等。在各種因素的壓迫下,細菌為了生存,不斷發(fā)生變異改變自身的機能來適應其不斷變化的生存環(huán)境。此外,細菌還可以通過質?；蜣D座子的水平轉移獲得其他物種的外源抗性基因,從而導致抗性變異的進一步發(fā)展。變異菌株再循環(huán)將這些特性遺傳給下一代,下一代就有更多的具有抗性的個體,經過長期的自然選擇,有些細菌就可以耐受生存環(huán)境中各種壓迫因素的影響。S.aureus對抗生素產生耐藥的原因之一是自然選擇的結果。在沒有使用人工合成抗生素之前,S.aureus在不斷的自然進化中對不利于它生存的物質已有一定的抗性能力。青霉素、衣霉素等天然抗生素是一些特定的微生物為了生存競爭獲得優(yōu)勢而分泌的次級代謝產物,以抑制其他微生物的生長。經過長期的接觸,S.aureus對這些天然抗生素就產生一定的抗性,如野生型葡萄球菌對新生霉素的天然抵抗[32]。

2.2 抗生素使用引起

抗生素的不斷開發(fā)及其過度使用甚至是濫用是S.aureus產生耐藥性的重要原因[33]。臨床上不必要或不適當的處方抗生素、堅持用抗生素治療非細菌性感染、患者未按照處方完成整個抗生素療程以及病人濫用抗生素等都是S.aureus對抗生素產生耐藥性的重要原因?？股氐膹V泛應用使S.aureus的適應能力比以往任何時候都要強大。一種新的抗生素被開發(fā)出來應用于臨床上,對其耐藥的S.aureus菌株很快就會產生。從第一種磺胺類抗菌劑到第一代抗生素(青霉素),以及后來的β-內酰胺類、大環(huán)內酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類等各種高效抗菌藥物[34]抗生素的作用靶點從葉酸代謝過程(磺胺類),到細胞壁的生物合成(青霉素、磷霉素、衣霉素、雷莫拉寧、萬古霉素等)、蛋白質的生物合成(四環(huán)素類、氨基糖苷類抗生素)以及DNA和RNA的復制(利福平、環(huán)丙沙星等)等已遍及S.aureus的整個生長繁殖過程(圖4)[35]。S.aureus通過與抗生素作用靶點密切相關的變異過程而獲得了耐藥性。新型抗生素的開發(fā)速度已經趕不上耐藥菌株產生的速度[36]。

圖4 S.aureus中抗生素作用靶點

2.3 消毒劑使用引起

消毒劑是抑制或殺滅傳播媒介上病原微生物,使其達到無害化要求的化學制劑。消毒劑作為切斷感染疾病傳播途徑、減少交叉感染的傳統重要手段,在醫(yī)療衛(wèi)生等眾多領域得到了廣泛使用。按其效果分類可分為高效消毒劑(如過氧化氫、二氧化氯、過氧化氫銀離子消毒劑等)、中效消毒劑(如碘類消毒劑、酒精等)和低效消毒劑(如胍類消毒劑、季胺鹽消毒劑等)3類。由于消毒劑不像藥物般具有一定的專一性,往往是起到預防感染的作用而使用于公共物品或公共場所中,對整個自然環(huán)境微生物都有一定的作用,再加上消毒劑的處理不當甚至是濫用等問題,長此以往,S.aureus已經對消毒劑具有一定的適應能力,導致其對消毒劑敏感性下降甚至出現抵抗增強的現象。這種抵抗機理與抗生素耐藥機制具有一定的相似性(如滲透屏障、外排作用等,如圖5)所示[37],可導致細菌對抗生素出現交叉耐藥現象。S.aureus對消毒劑敏感性降低的問題在很早以前就已經有報道,雖然目前消毒劑在適宜的濃度下仍然保持其殺菌的能力,但相關研究已發(fā)現,非致死濃度消毒劑能引起S.aureus對抗生素產生交叉耐藥現象[38]。由此可見,消毒劑也是S.aureus對抗生素耐藥性產生的重要原因。

圖5 消毒劑抵抗與抗生素耐藥性的關聯示意圖

2.4 抗菌中藥使用引起

具有抗菌活性成分的抗菌中藥在臨床上的應用已有幾千年的歷史,由于其來源廣泛,安全性高,毒性小,同時具有與化學藥不同的抗菌機制,已成為細菌耐藥性研究領域的熱點。相比化學藥來說,抗菌中藥多為復方組分,各成分之間具有一定相互關系,通常表現為整體量效作用,而不是簡單作用于某個單一的靶點,故一直被認為不容易產生耐藥性[39]?？咕兴幒推渌兴幰粯?它們的臨床運用目的主要是通過調節(jié)患者機體內環(huán)境的平衡等產生療效,而不是單純地用來殺死病原菌。因此多數情況下,抗菌中藥的臨床處方用量往往沒有達到病原菌的致死劑量,這導致整個療程中,患者體內病原菌可能沒有被殺死而使它們能夠適應抗菌中藥并出現對抗生素的交叉耐藥。近期研究發(fā)現黃連能引起細菌對抗生素的交叉耐藥和對消毒劑產生藥物抵抗。另外,抗生素和消毒劑的使用同樣能降低細菌對黃連的敏感性[40]。該實驗結果說明,大量抗菌中藥的藥渣隨意地排放至自然界,也是有可能誘導環(huán)境中細菌對抗生素產生交叉耐藥。因此,抗菌中藥的使用也是S.aureus對抗生素產生耐藥的潛在因素。

總之,抗生素耐藥性的產生可能是上述某種原因單獨所致,但更多的是幾種原因共同作用的結果,特別是抗生素交叉耐藥性的產生。因此,細菌耐藥性對策的制定和實施尤為重要。

3 細菌耐藥性對策

包括S.aureus耐藥在內的細菌耐藥性對全球公共衛(wèi)生造成嚴重威脅。為了應對這一持久的威脅,世界各國紛紛以盡量減少抗菌素耐藥性的發(fā)展和傳播、確保研究開發(fā)有效抗菌素為主要戰(zhàn)略目標,制定了相關的國家行動計劃,目前發(fā)布并實施的國家有74個,表2列出了部分國家主要戰(zhàn)略目標。

表2 各國應對細菌耐藥性的行動計劃

各國抗菌藥物的規(guī)范使用是抗擊耐藥性威脅的重要舉措?？股睾拖緞┦鞘澜绺鲊褂米疃嗟目咕幬?因此抗生素和消毒劑的規(guī)范使用對細菌耐藥性的防控、耐藥機制研究以及新型抗菌藥物的開發(fā)都具有重大意義。各國在制定行動計劃時也將抗菌藥物的規(guī)范使用列為主要目標,如中國明確指出全國二級以上醫(yī)院基本建立抗菌藥物臨床應用管理機制,使醫(yī)療機構主要耐藥菌增長率得到有效控制。英國通過國家政策和指導來規(guī)范醫(yī)生處方行為,要求醫(yī)生不得給患有感冒,咳嗽、扁桃體發(fā)炎、咽喉痛等癥狀的非適應癥患者開具抗生素處方。由于疾病種類及其復雜程度不同,就診對象及需求也存在差異,因此還制定了多層次抗生素用藥指南。

由于目前新型抗生素的研發(fā)處于瓶頸階段,抗菌中藥為預防和控制耐藥細菌感染提供了新的思路,這對使用抗菌中藥的國家來說是一個很好的機遇也是個重大的挑戰(zhàn)。在中國,黃連、黃柏、魚腥草、五倍子、金銀花等一百多種抗菌中草藥在S.aureus感染疾病的治療中廣泛運用。隨著現代醫(yī)藥的發(fā)展,為滿足患者的需求,很多中醫(yī)院都設有中藥代煎的服務,醫(yī)院必定會因此而產生一定量的抗菌中藥殘渣,而針對抗菌中藥殘渣的處理目前尚未有一個統一的方法。醫(yī)院本就是感染菌株的聚集地,如果抗菌中藥殘渣得不到有效的處理或隨意丟到環(huán)境中,其殘留的低于病原菌致死劑量的藥物濃度存在誘導病原菌產生抗生素耐藥的隱患。因此,抗菌中藥的規(guī)范使用應該引起足夠重視,需要制定出相關的政策規(guī)范抗菌中藥的使用,使抗菌中藥殘渣得到有效處理。這也是應對全球耐藥性威脅的重要策略。同時,包括中國在內的抗菌中藥使用國家應該積極開展抗菌中藥介導抗生素耐藥的機制研究,為遏制細菌耐藥性的進一步發(fā)展提供更加完善成熟的理論研究基礎。另外,加大抗生素耐藥機制研究的科研投入,充分了解耐藥性產生的機制,特別是抗生素與消毒劑交叉耐藥機制,是新藥開發(fā)的前提。新一代的抗菌藥物既要有效地抗擊各類病原菌,又要有效地降低它們產生耐藥的機會,這是新型抗菌藥物研發(fā)的一個前所未有的重大挑戰(zhàn)。

4 結語

細菌耐藥性對全球人類健康構成了嚴重的威脅。目前對抗生素耐藥機制、耐藥原因及對策的深入研究已迫在眉睫。S.aureus對抗生素主要耐藥機制有細胞壁結構改變、生物膜的形成、外排泵主動排出、產生滅活酶或鈍化酶和代謝途徑及作用靶位的改變等。而耐藥性產生的原因既有自然因素,也有人為因素。人為因素包括抗菌藥物(抗生素、消毒劑等)的過度使用甚至是濫用以及抗菌中藥殘渣不規(guī)范處理等。耐藥性的產生加速了后抗生素時代的到來。為減少耐藥性的出現,各國除了實施各自國家行動計劃,規(guī)范抗菌藥物的使用等策略之外,更需要加大對耐藥性機制,特別是交叉耐藥性機制研究的科研投入。另外,抗菌中藥作為預防和控制耐藥細菌感染的新資源,在規(guī)范其使用的同時,應加大抗菌中藥對耐藥菌逆轉作用及其機制的研究,為新型抗菌藥物的研發(fā)提供理論指導?？傊?解決細菌耐藥性問題需要全球人類共同努力與齊心奮戰(zhàn)。