湯友軍,魯曉翔,石俊杰,崔鈺涵,李明

(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300134)

從植物中提取的精油越來(lái)越多地被用作天然抗菌劑和抗氧化劑[1]。柑橘精油(citrus essential oil,CEO)是一種天然、無(wú)毒、無(wú)害的天然抗菌劑和植物添加劑,被普遍認(rèn)為是一種安全的物質(zhì)[2]。從植物組織中提取的柑橘精油具有抗氧化、抗微生物、抗炎、清除自由基、抗腫瘤以及細(xì)胞保護(hù)等多重功效[3-4],被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、藥品以及化妝品等領(lǐng)域[5]。

精油作為一種典型的疏水性物質(zhì),水溶性差,同時(shí),精油具有高揮發(fā)性,對(duì)光、熱、氧氣等環(huán)境因素敏感,穩(wěn)定性差[6]。鑒于此,開發(fā)具有高溶解度、強(qiáng)抗氧化和穩(wěn)定性的精油包埋技術(shù)是必要的。

微乳液(microemulsions,ME)是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按一定比例自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定、透明或半透明、各向同性的液體分散體系,粒徑為1～100 nm[7]。微乳液是油不溶性或水不溶性化合物運(yùn)輸和增溶的極好載體,是增強(qiáng)被包埋物水溶性和穩(wěn)定性的有效措施[8]。ME主要分為3類：水包油型(O/W)、雙連續(xù)的和油包水型(W/O)。每種ME類型的形成與油、兩親性物質(zhì)和水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及界面膜的性質(zhì)有關(guān)[9]。微乳液具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先,ME可以有效減少精油中生物活性化合物的揮發(fā),提高其在水中的溶解度和抗氧化活性;其次,ME可以很好地保護(hù)包埋物免受外部環(huán)境因素(如氧氣、溫度、光等)的影響,提高包埋物的生物利用率等[10]。ME作為一種疏水化合物的傳遞載體,在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[11]。

本研究采用滴加水法制備柑橘精油微乳體系來(lái)克服精油低水溶性、高揮發(fā)性等弊端,通過(guò)繪制偽三元圖優(yōu)化微乳體系形成的工藝條件,以制備穩(wěn)定的、可稀釋性柑橘精油微乳液(microemulsions containing citrus essential oils,ME/CEO)。采用粒徑分析、流變、溫度穩(wěn)定性和體外抗氧化活性等方法對(duì)制備的柑橘精油微乳液的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,以期為提高CEO穩(wěn)定性、生物利用率及商業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘精油,江西省吉水縣康民本草藥用油提煉廠。

吐溫 80、吐溫 60、吐溫 40、蘇丹紅III，均為化學(xué)純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇、亞甲基藍(lán),均為分析純,天津渤化化學(xué)試劑有限公司；1,2-丙二醇、丙三醇、正丁醇，均為分析純,天津市化學(xué)試劑供銷公司；抗壞血酸，分析純,天津市元立化工有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)，均為分析純,成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

H1850臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV—6100紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司；ME104/02電子天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BT90納米粒度分析儀,遼寧丹東百特儀器有限公司；MCR 301流變儀,奧地利安東帕公司；FE 28 pH 計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 偽三元圖的構(gòu)建

采用滴加水法制備柑橘精油微乳液,即通過(guò)在室溫下用水滴定油和表面活性劑的混合物的方法繪制擬三元相圖。各組分的最佳濃度是繪制擬三相圖的必要條件,并可用于確定微乳液的形成區(qū)域,以篩選出微乳體系的最佳配方。先配制表面活性劑與助表面活性劑的混合液,即混表面活性劑,兩者的質(zhì)量比為Km。以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的不同比例制備了油和混合表面活性劑的混合物,精密稱取混合于50 mL小燒杯中,在磁力攪拌器攪拌下緩慢滴加去離子水,溶液由澄清變渾濁,再變澄清,最終記錄臨界點(diǎn)樣品各成分的百分含量,試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行,以確保重現(xiàn)性,分別以油相、水相和混表面活性劑為三相圖頂點(diǎn),利用Origin 8.5軟件進(jìn)行偽三元圖的繪制,確定微乳液區(qū)域,利用Auto CAD 2007軟件計(jì)算微乳區(qū)域的面積。

1.3.2 柑橘精油微乳液的條件優(yōu)化

1.3.2.1 表面活性劑對(duì)ME/CEO形成的影響

表面活性劑分別選定為吐溫 40、吐溫 60、吐溫 80、吐溫 80+ 吐溫 40(1∶1,質(zhì)量比)、吐溫 80+ 吐溫 60(1∶1,質(zhì)量比),表面活性劑的HLB值如表1。將表面活性劑與無(wú)水乙醇按3∶1比例混合均勻作為混表面活性劑,按1.3.1制備微乳液,繪制擬三相圖。

表1 制備微乳液所選表面活性劑的特性

1.3.2.2 助表面活性劑對(duì)ME/CEO形成的影響

選取無(wú)水乙醇、1,2-丙二醇、甘油、正丁醇為助表面活性劑,混表面活性劑的比例為3∶1,按1.3.1制備微乳液,繪制擬三相圖。

1.3.2.3Km值對(duì)ME/CEO形成的影響

Km 為表面活性劑(吐溫 80與吐溫 40質(zhì)量比1∶1)與助表面活性劑無(wú)水乙醇的質(zhì)量比,Km 分別選定為 2、3、4、5,按1.3.1制備微乳液,繪制擬三相圖。

1.4 柑橘精油微乳液性質(zhì)的研究

1.4.1 粒徑分布、大小測(cè)定

采用納米粒度分析儀測(cè)定微乳液的液滴粒徑分布、多分散指數(shù)(polydispersiry,PDI)和平均粒徑。測(cè)試溫度為 25 ℃,散射角為90 ℃。

1.4.2 微乳液外觀和類型鑒定

微乳液制備完成后,按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),產(chǎn)品在保存期間應(yīng)保持透明或半透明,不發(fā)生分層或破乳等現(xiàn)象,視為合格。微乳類型用染色法鑒定[12]。

1.4.3 微乳液黏度、pH值、密度測(cè)定

微乳液的黏度用流變儀測(cè)定,取樣品0.5 mL,選用PP 50轉(zhuǎn)子,剪切速率范圍10-2～103s-1,掃描溫度25 ℃。

用pH計(jì)測(cè)定pH值。微乳液密度的測(cè)定參考陳碩等[13]的方法。

1.4.4 離心穩(wěn)定性

取適量制備好的柑橘精油微乳,于4 000、6 000、8 000、10 000 r/min下離心30 min,觀察是否分層,若無(wú)分層,以去離子水為空白對(duì)照,測(cè)定離心前后550 nm下的吸光度,透光率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中:T,透光率；A0,離心前微乳吸光度；A1,離心后微乳吸光度。

1.4.5 熱穩(wěn)定性

將適量的微乳液分別在40、50、60、70、80和90 ℃的恒溫水浴中加熱30 min。通過(guò)視覺(jué)觀察(相分離)和透光率來(lái)評(píng)價(jià)微乳液的穩(wěn)定性。以去離子水作為空白對(duì)照,使用紫外分光光度計(jì)在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)量加熱前后微乳液的吸光度,透光率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:A2,加熱前微乳液吸光度；A3,加熱后微乳液吸光度。

1.4.6 低溫穩(wěn)定性

將微乳液置于4 ℃低溫環(huán)境中儲(chǔ)存,采用公式(2)測(cè)定第1、5、15、30、60、90天微乳液的透光率。

1.4.7 CEO及其ME/CEO抗氧化活性的分析和比較

1.4.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

測(cè)定DPPH自由基的清除率參考ABD-ELGAWAD等[14]的方法,并稍加修改。DPPH粉末用無(wú)水乙醇溶解并稀釋成2 mmol/L的儲(chǔ)備液。取2 mL不同質(zhì)量濃度(2、4、6、8 mg/mL)的CEO和ME/CEO溶液加入2 mL 經(jīng)稀釋后的DPPH溶液,混合溶液在室溫下經(jīng)渦旋均勻后,避光反應(yīng)30 min,在 517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)i；以無(wú)水乙醇作為空白調(diào)零,以2 mL對(duì)應(yīng)濃度的樣品溶液加2 mL無(wú)水乙醇作為對(duì)照(Aj)；2 mL無(wú)水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光值為Ak。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,DPPH自由基的清除率按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.4.7.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考GUO等[15]方法,并稍加修改。取0.2 mL的待測(cè)樣品(CEO、ME/CEO)加入2 mL ABTS陽(yáng)離子自由基溶液中,將該混合物在室溫條件下渦旋混勻10 min,在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。測(cè)定2 mL ABTS陽(yáng)離子自由基溶液與樣品等體積的乙醇混合后的吸光度A0。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率按公式(4)計(jì)算：

(4)

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Origin 8.5 軟件繪圖,采用 SPSS 23對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑對(duì)ME/CEO形成的影響

表面活性劑是形成微乳液最基本的物質(zhì),選擇合適的表面活性劑對(duì)穩(wěn)定微乳液的形成極為重要,表面活性劑可以有效地降低界面張力,促進(jìn)微乳液的形成[16]。常用的表面活性劑有吐溫系列、司盤系列以及烷基葡萄糖苷等[17]。

從圖1可知,吐溫 80∶吐溫 40(1∶1,質(zhì)量比,HLB=15.3)是最好的表面活性劑,因?yàn)榕c其他表面活性劑相比,它在偽三元相圖中可以產(chǎn)生最大的微乳液區(qū)域。單一的表面活性劑有時(shí)很難達(dá)到理想的乳化效果,需要將表面活性劑進(jìn)行復(fù)配,提高其乳化能力[18]。研究表明,表面活性劑的復(fù)配可以增強(qiáng)微乳液的乳化能力,并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[19]。

表面活性劑為：a-吐溫 80；b-吐溫 60；c-吐溫 40；d-吐溫 80+吐溫 60(1∶1,質(zhì)量比)；e-吐溫 80+ 吐溫 40(1∶1,質(zhì)量比)

此外,從實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),表面活性劑的HLB不能用于確保微乳液的形成,這或許與吐溫的化學(xué)結(jié)構(gòu)和飽和度有關(guān)[20]。因此,選擇吐溫 80∶吐溫 40(1∶1,質(zhì)量比)作為最佳表面活性劑。

2.2 助表面活性劑對(duì)ME/CEO形成的影響

助表面活性劑對(duì)微乳液的穩(wěn)定性起著基礎(chǔ)性的作用,它主要鑲嵌在表面活性劑的分子之間,在油水界面形成混合吸附膜,降低界面膜的曲率和剛性,增強(qiáng)界面流動(dòng)性和柔性,調(diào)節(jié)表面活性劑HLB值,提高乳化效果,促進(jìn)微乳液的形成[21]。此外,助表面活性劑的作用效果與醇鏈的大小和所帶基團(tuán)有關(guān)[22]。

由圖2可知,正丁醇形成的微乳液區(qū)域最大,甘油最小,乳化效果為正丁醇>無(wú)水乙醇>1,2-丙二醇>甘油。結(jié)果表明,正丁醇作為助表面活性劑可以降低體系的黏度和表面張力,提高體系的流動(dòng)性,調(diào)節(jié)界面水相和油相的分布。因此,選擇正丁醇作為助表面活性劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

助表面活性劑為：a-無(wú)水乙醇；b-1,2-丙二醇；c-丙三醇；d-正丁醇

2.3 Km對(duì)ME/CEO形成的影響

由圖3可知,隨著Km值的增加,所形成微乳液的面積先增加后減少。與其他Km值相比,Km=4形成的微乳液區(qū)域最大,這可能與助表面活性劑鑲嵌在表面活性劑分子結(jié)構(gòu)的位置有關(guān)?？赡苁怯捎谡〈即嬖谟诒砻婊钚詣┖徒缑嬷g,并參與液滴界面膜的形成。同時(shí),它也分布在水相和油相中,改善了兩相的性能,導(dǎo)致界面張力降低和微乳液的形成[23]。因此,選擇Km=4進(jìn)行下一步研究。

a-Km=2；b-Km=3;c-Km=4;d-Km=5

2.4 微乳液配方的確定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定了ME/CEO的最佳配方為：m(吐溫 80)∶m(吐溫 40)=1∶1為表面活性劑,正丁醇為助表面活性劑,Km=4。如圖4所示,在混合表面活性劑與油相的所有比例(4∶6～9∶1)中都能得到均一、透明的ME/CEO,與微乳液的外觀特征相符。降低油相中乳化劑的濃度會(huì)使微乳液體系產(chǎn)生渾濁,當(dāng)比例低于4∶6時(shí),由于相分離迅速,系統(tǒng)變得不穩(wěn)定。因此,從載油量和乳化效果考慮,選擇微乳液配方7∶3作為樣品進(jìn)行下一步研究。

圖4 不同比例的相形成的微乳液

2.5 柑橘精油微乳液性質(zhì)的研究

2.5.1 粒徑分布、大小測(cè)定

粒徑和PDI決定了微乳液的性質(zhì),如光學(xué)外觀、長(zhǎng)期穩(wěn)定性等[24]。PDI值通常為0～1,PDI值越小,表明微乳液粒徑分布越集中,體系均一性越好[25]。結(jié)果表明,ME的粒徑分布均勻,呈單峰分布,平均粒徑為(28.83±0.95)nm,PDI為(0.06±0.05),微乳液液滴尺寸在納米范圍內(nèi),如圖5所示。

圖5 微乳液的粒徑分布

2.5.2 微乳液外觀和類型鑒定

染色法判定微乳液的類型是基于“相似相溶”原理,水溶性染料亞甲基藍(lán)在水相中擴(kuò)散速度快,而油溶性的蘇丹III在油相中擴(kuò)散速度較快。由圖6可知,亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度快于蘇丹III,表明制備的ME/CEO是O/W型。

圖6 染色法測(cè)定微乳液的類型

2.5.3 微乳液黏度、pH值和密度

流變學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)剪切速率為0.01～0 s-1時(shí),ME/CEO的黏度隨剪切速率的增大而降低。當(dāng)剪切速率>0 s-1時(shí),ME/CEO的黏度基本保持不變,表現(xiàn)出低黏度牛頓行為,平均黏度為(17.6±1.33)mPa·s,這可以歸因于它們的高含水量,如圖7所示。

圖7 不同剪切速率微乳液黏度的測(cè)定

表面活性劑是兩性化合物,在pH接近中性時(shí)不帶電。結(jié)果表明,配方7∶3的ME/CEO的pH值為6.54,接近中性。因此,可以得出表面活性劑不影響水的pH值。此外,微乳液的密度為(0.958±0.03)g/mL,小于水的密度。

2.5.4 離心穩(wěn)定性

如果微乳體系不穩(wěn)定,在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生渾濁、液體分層、絮凝等現(xiàn)象。因此,通過(guò)離心加速這一變化,來(lái)考察微乳液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在不同離心條件下,微乳液微乳外觀清澈透明,未發(fā)生相分離、凝固、乳化等現(xiàn)象,且透光率均大于100%,如圖8所示。表明微乳液體系具有良好的離心穩(wěn)定性。

圖8 不同離心速率下微乳液的透光率

2.5.5 溫度穩(wěn)定性

由圖9和肉眼觀察結(jié)果可知,不同加熱溫度下,微乳液的外觀呈清澈透明狀態(tài),透光率均大于92%。表明本研究所制得的ME/CEO具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖9 不同溫度下微乳液的透光率

將ME/CEO分別在4 ℃下保存1、5、10、15、30、60、90 d。ME/CEO的外觀清澈透明,未出現(xiàn)凝固、乳化、相分離等現(xiàn)象,透光率均大于95%,如圖10所示,且ME/CEO在4 ℃下至少能穩(wěn)定90 d。本研究所制備的ME/CEO在低溫條件下具有良好的穩(wěn)定性。

圖10 不同貯藏時(shí)間微乳液的透光率

2.6 CEO及其ME/CEO抗氧化活性的分析和比較

2.6.1 DPPH自由基清除率

DPPH乙醇溶液呈深紫色,在波長(zhǎng)517 nm處有最大吸收峰。在DPPH分子結(jié)構(gòu)中帶有未配對(duì)電子的氮原子可以捕獲自由基。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),它將與DPPH分子上的單個(gè)電子配對(duì),形成DPPH-H,使溶液顏色變淺或消失[26]。采用DPPH法分析比較了純揮發(fā)油和ME的體外抗氧化作用。CEO及其ME/CEO的DPPH自由基清除能力如圖11所示,結(jié)果表明,CEO和ME/CEO對(duì)DPPH自由基清除能力隨濃度的增加而增大,ME/CEO對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于CEO,但要弱于陽(yáng)性對(duì)照維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力(P<0.05)。

圖11 精油和微乳液的DPPH自由基清除率

2.6.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

ABTS被活性氧氧化生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS陽(yáng)離子自由基。在此物質(zhì)中加入抗氧化劑,與ABTS陽(yáng)離子自由基反應(yīng),使反應(yīng)體系變色,在734 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度變化[27]。它與抗氧化劑的生物活性有很強(qiáng)的相關(guān)性,在測(cè)定血清、果蔬等生物樣品的抗氧化能力方面得到了廣泛的應(yīng)用。CEO和ME/CEO對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力如圖12所示,CEO和ME/CEO具有較強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力；同時(shí),ME/CEO的抗氧化能力優(yōu)于CEO,且與濃度呈正相關(guān),但要弱于陽(yáng)性對(duì)照維生素C(P<0.05)。

圖12 精油和微乳液的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

含柑橘精油的微乳液配方能有效提高柑橘精油在水相環(huán)境中的抗氧化活性,但精油和微乳液的自由基清除能力要弱于維生素C。微乳液具有較強(qiáng)的自由基清除能力可能是由于體系中油相油滴粒徑的減小從而具有更大的反應(yīng)表面積、超低界面張力及納米級(jí)分散相等[28]。同時(shí),微乳液體系的抗氧化性能也強(qiáng)烈依賴于水相的含量,即使精油濃度降低,微乳體系的抗氧化活性也會(huì)隨著水相的增加而顯著提高[29]。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)微乳化技術(shù)構(gòu)建了柑橘精油微乳體系,解決了柑橘精油在水相環(huán)境中應(yīng)用受到制約以及穩(wěn)定性差等問(wèn)題。對(duì)制備的微乳體系進(jìn)行穩(wěn)定性(低溫、室溫、高溫以及離心)分析,微乳液體系沒(méi)有產(chǎn)生絮凝、分層、乳化和沉淀等不穩(wěn)定現(xiàn)象,表明微乳液具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。微乳液能夠有效地提高精油在水相環(huán)境中的抗氧化活性,具有開發(fā)天然抗菌劑和抗氧化劑的潛力。