肖健,蔡國(guó)林*,吳殿輝,李曉敏,陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

乳酸菌廣泛存在于人體的腸道中,能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)胃腸道菌群,從而調(diào)節(jié)胃腸道穩(wěn)態(tài)等,常用于食品生產(chǎn),但在啤酒釀造中卻應(yīng)用很少。在適當(dāng)?shù)臈l件下,啤酒可以作為乳酸菌的載體[1]。

在工業(yè)啤酒中,乳酸菌常被認(rèn)為是啤酒腐敗菌,影響啤酒口感,乳酸菌污染占啤酒釀造行業(yè)報(bào)告所有污染的70%。但并不是所有的乳酸菌都是啤酒腐敗菌[2]。酵母菌和乳酸菌都可以通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生各種風(fēng)味化合物來(lái)增加感官特征[3]。DYSVIK等[4]研究證明,植物乳酸菌與釀酒酵母共發(fā)酵釀造的啤酒比對(duì)照啤酒增強(qiáng)了果味和干果味。隨著消費(fèi)者對(duì)啤酒品質(zhì)和個(gè)性體驗(yàn)需求的提升,導(dǎo)致由小型啤酒生產(chǎn)線生產(chǎn),且在釀造過(guò)程中不添加與調(diào)整啤酒風(fēng)味無(wú)關(guān)的物質(zhì),風(fēng)味特點(diǎn)突出的工坊啤酒受到了廣大消費(fèi)者的青睞,而口感酸甜且富含乳酸菌的酸啤酒就是其中的一種[5]。工坊啤酒在酒精度和苦味值(以異α-酸計(jì))上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)工業(yè)啤酒,由于缺乏工坊啤酒釀造專用乳酸菌的選育等應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作,目前大部分乳酸菌不能耐受工坊啤酒的較高酒精度和高苦味值,導(dǎo)致酸啤酒良莠不齊,質(zhì)量波動(dòng)性大,難以達(dá)到消費(fèi)者的心理預(yù)期。

本研究主要通過(guò)乳酸菌的對(duì)酒精度和異α-酸耐受性的分析,結(jié)合益生潛力評(píng)價(jià),篩選獲得1株適用于工坊啤酒釀造用的乳酸菌,并開(kāi)發(fā)一款口感酸甜、醇厚豐滿且果香濃郁的工坊啤酒,同時(shí)還富含活性乳酸菌,以期進(jìn)一步拓展乳酸菌在發(fā)酵食品中的應(yīng)用,豐富工坊啤酒的品類。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶,無(wú)錫當(dāng)?shù)爻?；大麥麥?粵海永順泰集團(tuán)股份有限公司；酒花浸膏、酒花顆粒,上海金啤食品原料有限公司；釀酒酵母S-23,實(shí)驗(yàn)室保藏；酵母提取物蛋白胨,英國(guó)OXOID公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離

乳酸菌的分離按照KANG等[6]的方法執(zhí)行。

1.2.2 乳酸菌的初步篩選

將分離得到的乳酸菌進(jìn)行2次活化(37 ℃,12 h),按體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種于含有5%(體積分?jǐn)?shù),下同)酒精的MRS培養(yǎng)基中,12 ℃靜置培養(yǎng)7 d,每24 h測(cè)其OD600。將耐酒精優(yōu)勢(shì)菌株2次活化(37 ℃,12 h),按體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量分別接種于苦味值為25 BU的MRS培養(yǎng)基中,12 ℃靜置培養(yǎng)7 d,每24 h測(cè)其OD600。

1.2.3 啤酒釀造用乳酸菌的確定

乳酸菌細(xì)胞表面疏水性采用乳酸菌對(duì)2種碳?xì)浠衔锏酿じ降姆椒▓?zhí)行[7]。乳酸菌人工胃腸液耐受性按照印伯星[8]的方法執(zhí)行。

1.2.4 啤酒釀造用乳酸菌的鑒定

乳酸菌鑒定采用基于16S rDNA的方法進(jìn)行[9]。將乳酸菌的16S rDNA序列通過(guò)NCBI BLAST與Genebank中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA6軟件,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[10]。

1.2.5 乳酸菌啤酒的指標(biāo)測(cè)定

將大麥麥芽采用EBU磨進(jìn)行粉碎,以料水比為1∶5(g∶mL)進(jìn)行糖化,糖化工藝為：52 ℃保溫10 min,升溫至65 ℃保溫70 min,再升溫至72 ℃保溫10 min,最后升溫至78 ℃保溫10 min；糖化結(jié)束后過(guò)濾,用78 ℃水洗糟；煮沸60 min,期間酒花分3次添加,分別為煮沸0 min投入0.1 g/L馬格努門酒花,煮沸45 min時(shí)投入0.1 g/L馬格努門酒花,煮沸結(jié)束投入0.1 g/L卡斯卡特酒花；最終完成12°P定型麥汁。麥汁冷卻充氧后同時(shí)接種乳酸菌和酵母共同發(fā)酵,乳酸菌接種量為2%(體積分?jǐn)?shù)),酵母數(shù)量控制在7 lg CFU/mL,12 ℃發(fā)酵至日失量小于0.2 g/d；主發(fā)酵結(jié)束后,4 ℃進(jìn)行后發(fā)酵7 d。

酒精度、真正發(fā)酵度、原麥汁濃度、真正濃度參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進(jìn)行測(cè)定；pH值由pH計(jì)測(cè)定；總酸測(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；啤酒揮發(fā)性物質(zhì)按照YANG等[11]的方法測(cè)定；感官評(píng)價(jià)由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的20人品嘗小組按照100分的方法進(jìn)行,感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌酸啤酒感官評(píng)價(jià)表

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SOSS 22進(jìn)行分析,并進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 工坊啤酒釀造用乳酸菌的初步篩選

對(duì)酒花顆粒、啤酒發(fā)酵液和酸奶中分離得到形態(tài)不一,差異性較大的若干株乳酸菌進(jìn)行酒精和異α-酸耐受性實(shí)驗(yàn),其在酒精和異α-酸存在時(shí)的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。乳酸菌在5%的酒精下有較好的生長(zhǎng)。對(duì)其進(jìn)行耐高苦味值能力測(cè)定,篩選得到7株優(yōu)勢(shì)菌株,分別重新命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7(均來(lái)自于啤酒發(fā)酵液)。異α-酸對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有較大的抑制作用,它們作為離子載體,在胞質(zhì)膜上驅(qū)散pH梯度,降低質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)(proton motive force,PMF)。因此,依賴于PMF的養(yǎng)分吸收受阻,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。與其他菌株相比,菌株J6在5%酒精度和25 BU苦味值下生長(zhǎng)情況均為最佳。

a-耐酒精生長(zhǎng)曲線圖；b-耐異α-酸生長(zhǎng)曲線圖

2.2 乳酸菌的表面疏水性及人工胃腸液耐受性

乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附是其定植的前提,而乳酸菌表面疏水性是其黏附能力的重要表征[13]。乳酸菌的細(xì)胞表面疏水性結(jié)果如圖2所示。菌株J5和J6表現(xiàn)出良好的疏水性,其中菌株J6對(duì)2種碳?xì)浠衔锏酿じ铰首罡摺?/p>

圖2 七株優(yōu)勢(shì)乳酸菌表面疏水性

為了使乳酸菌更好的發(fā)揮其益生作用,它們應(yīng)該保持較高的胃腸道存活率。菌株J6在人工胃液和人工腸液2 h中的存活率分別達(dá)到77.6%和92.4%。劉江等[14]通過(guò)從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的植物乳桿菌,其在pH=3.0的培養(yǎng)基中16 h的存活率能夠達(dá)到87.29%,有很好的耐酸性,這與本研究結(jié)果一致。菌株J6在人工腸液2和4 h條件下,其存活率沒(méi)有顯著差異(P>0.05),且有很好的存活率。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,只有菌株J6在各項(xiàng)指標(biāo)中表現(xiàn)出較好的結(jié)果,其在5%酒精度和25 BU苦味值下生長(zhǎng)情況均為最佳,疏水性、人工胃液和人工腸液存活率分別達(dá)到81.6%(正辛烷)、77.6%(2 h)和92.4%(2 h)。故選用該菌株作為酸啤酒釀造菌株。進(jìn)一步采用16S rDNA測(cè)序,經(jīng)過(guò)BLAST分析,鑒定其為植物乳桿菌,將其命名為植物乳桿菌J6,構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌J6的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 植物乳桿菌J6在工坊啤酒中的應(yīng)用

對(duì)成品啤酒進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定,結(jié)果如表2所示。乳酸菌啤酒與對(duì)照啤酒在真正濃度、原麥汁濃度、發(fā)酵度和酒精度上沒(méi)有顯著差異性(P>0.05),表明乳酸菌的加入,并不會(huì)對(duì)啤酒常規(guī)理化指標(biāo)產(chǎn)生影響；這也與前人報(bào)道一致,劉彩霞等[15]研究干酪乳桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束其酒精度與對(duì)照啤酒之間沒(méi)有顯著性差異。但在pH和總酸含量這2個(gè)指標(biāo)與對(duì)照之間存在著極顯著性差異(P<0.01),且在口感上有著明顯酸感[16]；馬立娟等[17]在研究乳酸乳球菌、干酪乳桿菌和酵母之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌與酵母混合發(fā)酵比純酵母發(fā)酵能夠更大幅度的降低其pH。此外,乳酸菌啤酒中還含有7.34 lgCFU/mL的活性乳酸菌,一般認(rèn)為活性乳酸菌數(shù)>7.00 lgCFU/mL是比較滿意的水平[18]。乳酸菌啤酒色澤光亮,泡沫細(xì)膩,泡持性久,具有口感酸甜,酒體醇厚豐滿,香味協(xié)調(diào)且有更高的果香,得到較高感官評(píng)價(jià)分,而對(duì)照啤酒泡沫較細(xì)膩,酒香平淡,口感柔和。

表2 乳酸菌酸啤酒與對(duì)照啤酒指標(biāo)對(duì)比

乳酸菌酸啤酒和對(duì)照啤酒發(fā)揮性物質(zhì)濃度對(duì)比見(jiàn)表3。從表3可以看出,乳酸菌啤酒的總高級(jí)醇和總酯分別達(dá)到了149.25和47.60 mg/L,此對(duì)照組分別提高了19.48%和28.68%,其中乙酸乙酯和乙酸異戊酯顯著提高(P<0.05),比對(duì)照分別提高了26.86%和59.31%,這可能由于植物乳桿菌產(chǎn)生的乙酸被酵母代謝,產(chǎn)生了更多的乙酸乙酯和乙酸異戊酯[19]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,乙酸乙酯和乙酸異戊酯與水果味相關(guān)[4]。

表3 乳酸菌酸啤酒和對(duì)照啤酒揮發(fā)性物質(zhì)濃度

3 結(jié)論

分離得到1株具有耐高酒精度和耐高苦味值的植物乳桿菌J6,體外益生潛力評(píng)價(jià)表明,該菌對(duì)正辛烷和正十六烷的疏水性分別是81.6%、80.0%,在人工胃液和人工腸液2 h存活率分別是77.6%、92.4%。同時(shí),在與釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)有更好的感官評(píng)價(jià),泡沫細(xì)膩,泡持性久,口感酸甜,酒體醇厚豐滿,香味協(xié)調(diào),總高級(jí)醇和總酯含量分別達(dá)到了149.25和47.60 mg/L,更重要的是,還富含活性乳酸菌,大大提高了啤酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,符合當(dāng)今消費(fèi)者的需求。