彭志蘭,馮暢,陳貝貝,曹文紅,2,高加龍,2,秦小明,2,章超樺,2*

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東 湛江,524008) 2(國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江),廣東 湛江,524008)

由于臭氧層的破壞,更多的紫外線(ultraviolet light,UV)穿過臭氧層輻射到地球表面,患皮膚疾病的患者逐年增多,嚴重危害人民群眾的身心健康。輻射到地面的UV,按照其波長可以分為3種、UVA(320～420 nm)、UVB(275～320 nm)和UVC(200～275 nm),其中UVB能穿過表皮層,直達表皮層與真皮層交界面,是導致皮膚光老化發(fā)生的主要原因[2]。皮膚光老化是一種由過多UV不斷輻射積累造成的皮膚早衰現(xiàn)象[1],不僅損害容貌美觀,而且與許多疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。如何預防和治療皮膚光老化已成為皮膚和化妝品研究領域的熱點。

過多的UVB輻射皮膚不僅會對細胞里的生物大分子(蛋白質(zhì)和DNA)造成損傷,而且還會減低細胞內(nèi)抗氧化酶的活性,導致細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量升高。過量的ROS通過MAPK信號通路促進基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表達,加速細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中膠原纖維的降解,從而導致皮膚膠原蛋白流失,加速皺紋的形成[4-5]。膠原蛋白前體對于膠原蛋白的形成起著至關重要的作用,因此抑制ROS的活性和抑制膠原蛋白的降解為預防和治療光老化提供了新的策略。

香港牡蠣(Crassostreahongkongensis),是分布于我國南部沿海的一種重要的養(yǎng)殖貝類[6]。據(jù)明代李時珍所著《本草綱目》記載：“牡蠣肉,炙食甚美,令人細肌膚,美顏色”[7]。前期研究發(fā)現(xiàn),牡蠣具有抗氧化、抗炎、降血壓、解酒護肝和抗腫瘤等功效[6]。雖有研究報道牡蠣水解產(chǎn)物能抑制UVB輻射后小鼠皮膚黑色素和皺紋的形成,然而關于牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物抗UVB誘導的皮膚光老的研究報道相對較少。

本研究首先采用堿沉酸提的方法提取牡蠣分離蛋白,再用中性蛋白酶進行酶解獲得牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物(oyster protein enzymatic hydrolysate,OPEH),逐級通過分子篩獲得4個超濾組分。通過對比OPEH和這4個超濾組分的體外總抗氧化能力,在UVB輻射誘導的HaCaT光老化細胞模型上,評價OPEH及其超濾組分的抗皮膚光老化的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣，廣東省湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場；維生素C(PHR1008)，美國Sigma公司；DMEM基礎培養(yǎng)基(C11995500BT)、胎牛血清(10100147)，Gibco 生物公司；0.25%的胰酶(J170025), Hyclone生物公司；中性蛋白酶(30萬U/g)，龐博生物工程有限公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學公司；活性氧檢測試劑盒(S0033S)，碧云天生物技術有限公司；I型膠原蛋白前體測定試劑盒(E-EL-H0181c)，Elabscience生物技術有限公司；人永生化角層細胞，蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置在5% CO2, 37 ℃的恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 儀器與設備

UVB紫外燈管(9 W),飛利浦照明有限公司；Varioskan Flash全自動酶標儀,美國Thermo公司；FD-551大型立式冷凍干燥機,東京理化器械公司；DM2000 LED熒光倒置顯微鏡,德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 OPEH和各超濾組分的制備

牡蠣蛋白提取工藝參照鄭慧娜等[9]的實驗方案,采用堿提酸沉的方法(堿提pH=12,酸沉pH=4.8)從新鮮牡蠣全肉中提取牡蠣蛋白,制成凍干粉。采用中性蛋白酶酶解牡蠣蛋白(物料比為1∶3,加酶量為6 000 U/g蛋白質(zhì),50 ℃,3 h)。滅活中性蛋白酶后(90 ℃,10 min),離心取上清液(1×104r/min,20 min)獲得OPEH。然后將上清液逐級通過8 k、5 k、3 kDa分子篩超濾膜,共截留出<3 kDa(OPEH-1)、3 k～5 kDa(OPEH-2)、5 k～8 kDa(OPEH-3)和>8 kDa(OPEH-4)4個超濾組分。

1.3.2 OPEH及各超濾組分體外總抗氧化能力測定

OPEH及各超濾組分的總抗氧化能力測定采用的是ABTS法,具體操作步驟參照產(chǎn)品說明書。

1.3.3 UVB輻射和HaCaT細胞活力的測定及細胞形態(tài)觀察

HaCaT細胞在T25細胞培養(yǎng)瓶中長到70%～80%時,用0.25%的胰酶消化細胞,制成細胞懸液。向96孔板種植細胞(1×104個/孔)。待細胞完全貼壁后,吸干培養(yǎng)基,用PBS溶液將細胞清洗3遍,并在底部留少許液體。將96孔板置于由8根并排排列的UVB紫外燈管(9 W,發(fā)射光譜在285～350 nm之間,峰值在310～315 nm,燈管距離孔板16 cm)所組成的輻射儀下。參考XIAO等[10]實驗方案,以35 mJ/cm2的輻射強度照射細胞,隨后向細胞加入100 μL 混有待測樣品的DMEM基礎培養(yǎng)基。24 h后,測定CCK-8試劑盒細胞活力。并在倒置顯微鏡下拍照記錄HaCaT細胞的形態(tài)。

1.3.4 細胞外I型膠原蛋白前體表達的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒測定I型膠原蛋白前體在HaCaT 細胞外含量。首先在24孔板接種HaCaT細胞(1×105個/孔),如1.3.3節(jié)所示進行紫外輻射和給藥處理。24 h后,收集培養(yǎng)基,離心(2 500 r/min,4 ℃,20 min),收取上清液,參照ELISA試劑說明書進行濃度測定。

1.3.5 細胞內(nèi)ROS表達的測定

用活性氧檢測試劑盒檢測HaCaT 細胞內(nèi)ROS的生成。在24孔板或者96孔熒光酶標板接種HaCaT細胞(分別為1×105個/孔,1×104個/孔),如1.3.3節(jié)所示進行紫外輻射和給藥處理。12 h后,吸出培養(yǎng)基,加入新鮮無血清含10 μmol/L DCFH-DA培養(yǎng)液,37 ℃避光孵育20 min。隨后,用PBS溶液沖洗細胞3次。在熒光倒置顯微鏡下拍照記錄24孔板中DCF的熒光信息強度，或者在熒光酶標儀上檢測96孔熒光酶標板中DCF熒光的強弱。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、結(jié)合LSD法進行組間對比,P<0.05,為有顯著性差異,P<0.01,為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPEH及各超濾組分體外總抗氧化能力比較

采用ABTS法測定OPEH及各超濾組分體外總的抗氧化能力[14]。由表1可知,OPEH-1、OPEH-2以及OPEH均表現(xiàn)出較好的ABTS陽離子自由基清除能力,其ABTS陽離子自由基半清除質(zhì)量濃度分別為156.083、273.505和243.133 μg/mL。其中OPEH-1的ABTS陽離子自由基半清除質(zhì)量濃度最低,說明OPEH-1具有最好的體外總的抗氧化能力。

表1 OPEH及各超濾組分ABTS陽離子自由基抑制質(zhì)量濃度的比較

前期的研究表明UVB輻射皮膚后,會抑制皮膚組織中的抗氧化酶體系,加速抗氧化物質(zhì)的降解,造成體內(nèi)大量的氧化自由基的積累[11-12]。據(jù)報道富含疏水性氨基酸的多肽有很強的抗氧化活性[15]。本課題前期研究表明OPEH-1富含多種疏水氨基酸,占到所有游離氨基酸的41.81%[7],另外通過LC/MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPEH-1主要是由一系列分子質(zhì)量小于2 kDa(占總成分的95.6%)的小分子肽組成。而來自于深海魚類的海洋膠原蛋白肽以及從羅非魚明膠和鱈魚皮中提取的小分子肽,被報道具有抗皮膚光老化的活性[15]。因此我們推測具有較好體外抗氧化能力的OPEH-1具有潛在的抗皮膚光老化活性。

2.2 OPEH及各超濾組分細胞對HaCaT 細胞活力的影響

角質(zhì)形成細胞是皮膚組織表皮層的主要細胞類型,在皮膚防御方面起著關鍵作用。在其不斷的細胞分化和更新過程中,細胞的形態(tài)大小和排列有規(guī)律地發(fā)生變化,最后形成富含角蛋白的角質(zhì)層細胞[10],其過度地衰老和凋亡也是皮膚光老化的一個典型的病理特征[15]。由圖1可知,與對照組相比較,35 mJ/cm2輻射強度的UVB輻射人角層HaCaT 細胞后,細胞活力顯著地下降(P<0.01),細胞活力僅為對照組的61%左右。前期研究表明,當細胞活力在 60%左右的時候,細胞不至于因UVB 輻射而受損過重,同時細胞中與抗光老化相關的蛋白會有所表達,可認為在此輻射劑量下光老化的細胞模型造模成功[10]。對UVB輻射后的HaCaT 細胞加入不同質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物及其各超濾組分處理細胞24 h 后,OPEH-1、OPEH-2、OPEH均能對UVB輻照后光老化HaCaT細胞的細胞活力具有保護作用,并且呈現(xiàn)出較好的劑量依賴性。OPEH-1在質(zhì)量濃度>50 μg/mL 后就能顯著地提升UVB輻照后HaCaT細胞的活力。OPEH-2、OPEH在質(zhì)量濃度>100 μg/mL 后也能顯著地能提升UVB輻照后HaCaT細胞的活力(P<0.05)。從CCK-8的實驗結(jié)果可知,在UVB損傷的HaCaT光老化細胞模型上,OPEH-1表現(xiàn)出最好的抗光老化活性。

圖1 牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物及各超濾組分對UVB輻射后的HaCaT細胞活力的影響

2.3 OPEH及各超濾組分對UVB誘導的HaCaT細胞形態(tài)的影響

前期研究表明,當HaCaT細胞受到不良刺激時候,伴隨細胞活力的下降,細胞的形態(tài)也會相應發(fā)生改變[1]。如圖2所示,正常的 HaCaT細胞排列緊密,細胞形態(tài)一致,呈橢圓形且邊界清晰,細胞透光性較好。在模型組中,UVB 輻射HaCaT細胞后出現(xiàn)細胞間隙變大,細胞皺縮,形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則的改變,細胞邊緣變得模糊,并伴隨有細胞碎片的產(chǎn)生。對UVB輻射后的HaCaT 細胞加100 μg/mL的OPEH及各超濾組分處理細胞24 h 后,與細胞活力測試結(jié)果一致,在質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的給藥下,OPEH-1、OPEH-2、OPEH均對UVB輻射后HaCaT細胞形態(tài)的改變有略微改善作用。與細胞活力測定結(jié)果一致,OPEH-1對UVB輻射造成的HaCaT細胞形態(tài)改變具有最好的改善作用,雖然略有細胞碎片發(fā)生,細胞形態(tài)基本恢復到空白對照組的水平,與5 μg/mL的陽性對照藥物維生素C的效果相當。

a-CT;b-UVB;c-UVB+OPEH-1;d-UVB+OPEH-2;e-UVB+OPEH-3;f-UVB+OPEH-4;g-UVB+OPEH h-UVB+VC

2.4 OPEH及各超濾組分對UVB誘導的HaCaT細胞外I型膠原蛋白前體產(chǎn)生的影響

膠原蛋白是一種小分子蛋白質(zhì),絲狀的膠原蛋白纖維能使皮膚保持結(jié)實而有彈性[16]。皮膚光老化會導致人體膠原蛋白含量會逐漸流失,使得真皮層的彈性與保水度降低,表皮形成松垮的皺紋。膠原蛋白前體對于膠原蛋白的形成起到至關重要的作用。如圖3所示,ELISA結(jié)果顯示,UVB輻射后,HaCaT細胞分泌到細胞外的I型膠原蛋白前體水平顯著地下降(P<0.01)。OPEH及各超濾組分中,只有OPEH-1能顯著地提高I型膠原蛋白前體的分泌(P<0.01)。

圖3 OPEH及各超濾組分對UVB輻射后的HaCaT細胞外I型膠原蛋白前體及細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

2.5 OPEH及各超濾組分對UVB輻射誘導的HaCaT細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

有報道稱半胱氨酸、維生素C及羅非魚膠原肽能有效地清除細胞內(nèi)的 ROS,從而對UV誘導的細胞氧化應激和凋亡起到保護作用[17-18]。從圖4-b 可知,UVB輻射后,導致HaCaT細胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生(P<0.01),OPEH以及各超濾組分和陽性對照藥物維生素C均能極顯著地抑制ROS的產(chǎn)生(P<0.01)。從圖4同樣可見,CT組使用DCFH-DA熒光探針孵育細胞20 min后,細胞內(nèi)僅出現(xiàn)微弱的綠色熒光。模型組經(jīng)UVB輻射HaCaT細胞后,細胞內(nèi)大量的ROS產(chǎn)生,經(jīng)熒光探針染色后,細胞內(nèi)可見大量的綠色熒光。OPEH及各組分、陽性對照藥物維生素C均能減弱了細胞內(nèi)綠色熒光的強度,抑制ROS的產(chǎn)生。我們可以看出OPEH-1、OPEH-2、OPEH抑制細胞內(nèi)ROS的效果與陽性對照藥物維生素C的效果相當。

a-CT;b-UVB;c-UVB+OPEH-1;d-UVB+OPEH-2;e-UVB+OPEH-3;f-UVB+OPEH-4;g-UVB+OPEH;h-UVB+VC

3 結(jié)論與討論

本研究通過中性蛋白酶酶解香港牡蠣蛋白制備OPEH,逐級通過8 k、5 k、3 kDa 分子篩超濾后,共截留出4個超濾組分。研究表明,OPEH-1(<3kDa)具有最佳的體外抗氧化能力。同時在UVB誘導的HaCaT光老化細胞模型上,OPEH-1能顯著地提高UVB損傷后的HaCaT細胞的細胞活力,保護HaCaT細胞形態(tài)的改變。進一步的研究表明,OPEH-1的抗皮膚光老化活性可能與抑制細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,以及促進細胞外I型膠原蛋白前體產(chǎn)生有關。本研究也提示小分子質(zhì)量的牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物可用于抗皮膚光老化保健食品和化妝品的開發(fā)和利用。在本研究的基礎上,后續(xù)研究還需要在動物模型上驗證對該超濾組分的抗皮膚光老化的活性，以及通過進一步的分離,純化,鑒定具體的抗皮膚光老化活性成分。