程旭，廖立敏

（1.重慶化工職業(yè)學院，重慶400020；2.內江師范學院化學化工學院，四川內江641100）

血橙，是蕓香科柑橘屬的一個品種。由于果實中帶有血紅色，因而被稱為血橙。血橙主產非洲北部和歐洲南部地中海沿岸各國，中國亦有大量種植，僅在四川內江資中縣就有約1萬hm2，年產量超過10萬噸。血橙除用于鮮銷外，基本被用于生產血橙飲料，在血橙飲料生產過程中大約產生占鮮果40%的皮渣。大部分血橙皮渣沒有得到有效利用而直接被拋棄于環(huán)境中，既浪費資源又給當地環(huán)境帶來負面影響。柑橘類果皮渣中含有色素[1-2]、苦素[3-4]、橙皮苷[5-6]、黃酮[7-8]、多糖[9-10]等多種有效成分，其中多糖類物質含量在30%以上。植物多糖具有良好的抗氧化、抗癌、加強腸道蠕動等功能[11-12]，被廣泛應用于保健品、功能食品和藥品中。近期有學者發(fā)現植物多糖對促進動物生長、調節(jié)免疫力、改善動物的肉質等具有積極的作用，因而可以作為添加劑被用于功能飼料[13-15]。對血橙皮中的多糖類物質進行提取，對于有效利用血橙皮渣、減輕當地環(huán)境壓力等具有重要的意義。目前提取植物組織中的有效成分的方法主要有熱水浸提法[16]、超聲波提取法[17]、微波提取法[18]、酶法[19]、內部沸騰法[20-22]等。 熱水浸提法耗時耗能，提取率低下；超聲波提取過程中產生刺耳的噪聲，對操作者不利；微波提取過程中溶劑升溫快、反應劇烈，對熱不穩(wěn)定性物質破壞嚴重；酶法提取過程中對條件的控制較為嚴格；內部沸騰法因操作簡便、無需特殊儀器設備、耗時短、提取率高而受到研究者的重視。本文在常規(guī)的內部沸騰法的基礎上加以改進，降低反應體系的壓力，使其在達到溶劑沸點或低于溶劑沸點時依然能產生劇烈的內部沸騰，有效加快提取速率和提高多糖得率。通過響應面法優(yōu)化提取工藝，為開發(fā)利用血橙皮多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮血橙：產自四川省資中縣；去離子水；新制的Schiff試劑、0.5%高碘酸水溶液；無水乙醇、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、溴化鉀（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

電子分析天平（CP2202S）：北京賽多利斯儀器公司；高速萬能粉碎機（FW200）：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-95B）：上海互佳儀器設備有限公司；高速臺式離心機（TGL-10C）：上海安亭科學儀器廠；超純水機（U HP-Ⅳ-20T）：成都超純水科技有限公司；超級恒溫水浴槽（HH-601）：江蘇金壇億通電子公司；紫外-可見分光光度計（752型）：上海精密科學儀器有限公司；紅外光譜儀（FTS-40型）：美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理

將新鮮血橙清洗干凈，取皮，于60℃的下烘干至恒重，將血橙皮用高速粉碎機粉碎3 min，得到血橙皮粉末，用塑料袋密封置于干燥器中備用。

1.2.2 血橙皮多糖提取

稱取3.0 g血橙皮粉末置于錐形瓶，加入一定體積分數的乙醇溶液20 mL，浸泡20 min，使乙醇溶液充分進入血橙皮粉末內部，將一定溫度、一定體積的熱水加入到燒杯中，迅速轉入相同溫度的恒溫水浴鍋中，裝好裝置，開啟真空泵，使體系壓力降至38 kPa。乙醇在植物組織內部產生沸騰，提取一定的時間后冷卻至室溫（25℃），在離心機中4 000 r/min離心5 min。將上清液加入無水乙醇進行沉淀，過濾，無水乙醇洗滌至白色，濾餅轉移至蒸發(fā)皿中，70℃下真空干燥至恒重，得多糖粉末，用于多糖鑒定。將上清液轉入比色管中，去離子水定容到一定的體積得多糖含量待測液。

1.2.3 多糖的鑒定

1.2.3.1 高碘酸-希夫試劑反應（peri-odic acid Schiff，PAS）

準確稱取血橙皮多糖粉末5 mg于燒杯中，去離子水溶解后轉移至50 mL容量瓶中定容，搖勻。取2 mL于試管中，加入2滴～3滴0.5%高碘酸水溶液反應約10min，加入2滴～3滴新制的Schiff試劑，反應約10min后觀察現象[23]。

1.2.3.2 紫外光譜

取適量1.2.3.1中多糖溶液，以去離子水為參比，在波長范圍190 nm～400 nm內進行紫外光譜掃描，獲得紫外光譜圖。

1.2.3.3 紅外光譜

取1 mg血橙皮多糖與100 mg KBr粉末，用瑪瑙研缽研磨均勻，壓成薄片，用紅外光譜儀在400 cm-1～4 000 cm-1波數范圍內掃描，獲得紅外光譜圖。

1.2.4 血橙皮多糖含量測定及得率計算

精密稱取葡萄糖7.4 mg于燒杯中，去離子水溶解后轉移至50 mL的容量瓶中，去離子水定容至刻度線，搖勻得0.148g/L的葡萄糖標準溶液。精密稱取5.0000g苯酚溶于燒杯中，去離子水溶解后轉移至100 mL的容量瓶中，去離子水定容至刻度線，搖勻得5%的苯酚溶液。多糖的測定采用苯酚-硫酸法，分別精密移取0、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標準溶液于比色管中，分別加去離子水稀釋到2.0mL，再加1.0mL的5%的苯酚溶液，加入5.0 mL濃硫酸，邊加邊搖勻，靜置20 min冷卻至室溫（25℃），去離子水為空白溶液，在紫外區(qū)域掃描，發(fā)現在波長為490nm處吸光度最大。490nm下測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，得標準曲線方程為A=1.016C-0.110 7，R2=0.998 5。

待測液稀釋到合適體積，取1 mL按苯酚-硫酸法測定其吸光度，按標準曲線計算多糖含量，按式（1）計算血橙皮多糖得率。

1.2.5 試驗設計

單因素試驗，以乙醇體積分數50%、液料比20mL/g、提取溫度60℃、提取時間10 min為基礎，固定其中3個參數，改變其中1個參數以研究其對提取的影響。

響應面試驗，在單因素試驗初步確定的最優(yōu)試驗條件附近，運用響應面試驗（Box-Behnken Design）進一步優(yōu)化提取工藝條件。選取的因素及設計的水平，見表1。

表1 因素及水平Table 1 Factors and levels

2 結果與討論

2.1 多糖的鑒定

在高碘酸-希夫試劑反應（PAS反應）中，試管溶液中出現紫紅色化合物。高碘酸作為強氧化劑，打開了多糖的C-C鍵，使多糖分子中的醇羥基氧化為醛基，醛基與希夫試劑結合，生成了紫紅色化合物。高碘酸-希夫試劑反應對于二醇基有特異性，多糖殘基富含二醇基，因而希夫試劑對多糖具有特異性。試驗現象說明提取的樣品中有多糖的存在。

血橙皮多糖紫外光譜圖見圖1。

圖1 血橙皮多糖紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of polysaccharides

圖1中可以看出血橙皮多糖溶液在194 nm附近出現最大吸收，在260 nm和280 nm處均沒有出現特征吸收，說明提取物中沒有蛋白質和核酸等雜質，提取物的主要成分為多糖類物質。

血橙皮多糖紅外光譜圖見圖2。

圖2中發(fā)現具有典型的多糖特征吸收峰（3 413、2 933、1 607、1 419、1 159、1 025 cm-1）。其中 3 413 cm-1處的寬峰是O-H鍵的伸縮振動；2 933 cm-1處小的吸收峰為C-H伸縮振動引起的吸收峰，這兩組吸收峰是糖類物質的特征吸收峰，說明提取出的物質為多糖[24]。1 607 cm-1處是羧基的C=O雙鍵伸縮振動吸收峰；1 419 cm-1和1 159 cm-1是甲基的對稱C-H彎曲振動和羧基C-O單鍵伸縮振動引起的吸收峰；1 025 cm-1的吸收峰表明存在C=O鍵和吡喃糖環(huán)結構，以上可以說明提取物主要為多糖類物質。

圖2 血橙皮多糖紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of polysaccharides

2.2 單因素試驗

乙醇體積分數對血橙皮多糖提取的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對提取的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction

乙醇體積分數對血橙皮多糖提取的影響主要表現在兩個方面，一是影響提取過程產生內部沸騰的劇烈程度，二是影響溶劑的極性從而影響多糖類物質的溶解。從圖3可以看出，在低濃度時血橙皮多糖的得率隨著乙醇體積分數的增大而提高，說明了乙醇濃度低，內部沸騰不劇烈，從而影響了多糖的提?。浑S著乙醇體積分數的增大，內部沸騰越來越劇烈，多糖得率也隨之升高。當乙醇體積分數大于50%后，多糖得率有所下降，說明了血橙皮多糖具有一定水溶性，乙醇體積分數過高影響了水對血橙皮多糖的溶解，從而影響血橙皮多糖實際得率。因而，初步確定乙醇的體積分數為50%左右。

液料比對血橙皮多糖提取的影響見圖4。

從圖4中可以發(fā)現在低液料比時，血橙皮多糖的得率隨著液料比的增大而增大，說明了液料比越大，多糖溶出越多，植物組織內部殘留量就越低。液料比超過20 mL/g后，多糖得率略有上升。但是液料比過大，會增加后續(xù)處理的工作量，且浪費資源。因而，初步確定液料比為30 mL/g左右。

圖4 液料比對提取的影響Fig.4 Effect of Effect of liquid-to-solid ratio on extraction

提取溫度對血橙皮多糖提取的影響見圖5。

圖5 提取溫度對提取的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction

提取溫度主要影響產生內部沸騰的劇烈程度、分子運動的速率、多糖的溶解度及水解，從而最終影響血橙皮多糖的實際得率。圖5顯示提取溫度越高，血橙皮多糖得率越高。由于在減壓下提取，當溫度為60℃時已經產生了劇烈的內部沸騰，多糖得率具有較大值。溫度繼續(xù)升高，多糖得率緩慢上升，從提高多糖得率方面考慮，應該將提取溫度設定在70℃左右。

提取時間對血橙皮多糖提取的影響見圖6。

圖6 提取時間對提取的影響Fig.6 Effect of time on extraction

多糖類物質由植物組織內部向外擴散是需要時間的，當提取時間10 min時擴散達到平衡，繼續(xù)延長時間，多糖的得率也不會有明顯地增加。多糖在溶液中高溫暴露時間太長，部分多糖可能降解，可能導致實際得率下降。因而綜合考慮后應該確定提取時間在10 min左右。

2.3 響應面試驗

通過Box-Behnken Design共設計了29組試驗，響應面試驗安排及結果列入表2。

表2 試驗安排及結果Table 2 Experimental arrangement and results

續(xù)表2 試驗安排及結果Continue table 2 Experimental arrangement and results

將提取條件乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2作為自變量，血橙皮多糖得率作為因變量Y，建立多元線性回歸方程，如式（2）。

N為回歸點數，R為相關系數，SD為標準偏差，F是顯著性檢驗值。相關系數（R）高達0.913，說明模型擬合效果良好。方差分析結果，見表3。

表3 方差分析結果Table 3 Anova results

表3中可以發(fā)現，模型是顯著的，說明選取一次項和二次項作為自變量進行建模是合理的。一次項液料比（B）、提取時間（D）對血橙皮多糖得率影響顯著，說明在試驗過程要嚴格控制。二次項CD對血橙皮多糖得率影響較為顯著，其余各項對血橙皮多糖得率影響不顯著。模型相關系數大于0.9，說明選取乙醇體積分數（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）進行優(yōu)化是合理的。

響應面圖是響應值（血橙皮多糖得率）對各影響因素所構成的三維立體空間曲面圖，圖7和圖8表示在其它影響因素不變的情況下乙醇體積分數（A）和液料比（B）交互作用、提取溫度（C）和提取時間（D）交互作用對血橙皮多糖得率影響曲面圖。

圖7 乙醇體積分數、液料比及交互作用對提取的影響Fig.7 The effect of ethanol volume fraction,liquid-to-material ratio and interaction on extraction

圖8 提取溫度、提取時間及交互作用對提取的影響Fig.8 Effect of extraction temprature,extraction time and interaction on extraction

圖7中等高線平行或共圓心趨勢較強，說明乙醇體積分數（A）和液料比（B）交互作用不顯著，AC、AD、BC、BD交互影響也不顯著，響應面圖形與圖7類似。圖8中等高線相對來說不平行、不共圓心的趨勢明顯，說明提取溫度（C）和提取時間（D）交互作用較為顯著，與表3分析結果一致。

利用回歸模型對各提取條件下血橙皮多糖得率進行了預測，預測值及誤差列于表2。模型對多糖得率預測值與試驗值相關圖見圖9。

為便于觀察模型預測結果，將模型預測值與試驗值相關圖繪于圖9，圖中可以發(fā)現大部分樣本點都處于45°對角線附近，說明模型對各提取條件下血橙皮多糖得率預測值與試驗值具有較好的相關性，兩者差別較小。模型預測誤差分布圖見圖10。

圖9 模型對多糖得率預測值與試驗值相關圖Fig.9 Cal.vs.Exp.of the yield of lpolysaccharides

通常對于一個優(yōu)良的模型要求大部分樣本的預測誤差不得超過正負2倍標準偏差（±2SD）。圖10中可以看到全部樣本點都落在模型的±2SD范圍內，沒有樣本點的預測誤差超出此范圍，說明模型預測準確性高，可以用于對減壓內部沸騰法提取血橙皮多糖的工藝進行分析。

圖10 模型對多糖得率預測誤差分布Fig.10 Distribution of the prediction error of the model for the yield of polysaccharides

2.4 最優(yōu)工藝條件的確定與驗證

由多元線性回歸方程在設定的范圍內求得減壓內部沸騰法提取血橙皮多糖的最優(yōu)工藝條件：乙醇溶液體積分數為55%、液料比為35 mL/g、提取溫度為80℃、提取時間為10 min，血橙皮多糖得率的模型預測值為29.2%。在此條件下分別進行3次平行試驗，結果分別為28.6%、28.7%、28.5%，平均值為28.6%，與模型預測值接近，表明響應面試驗得到的血橙皮多糖提取工藝是正確的，同時也驗證了模型預測的準確性高。在此條件下血橙皮多糖得率高，試驗重現性好。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗，得到了減壓內部沸騰法提取血橙皮多糖的最優(yōu)工藝，即乙醇溶液體積分數為55%、液料比為35 mL/g、提取溫度為80℃、提取時間為10 min，此條件下血橙皮多糖得率可達28.6%。減壓內部沸騰法操作簡單，提取率高，提取過程無需加入有毒有害物質，提取物可以直接作為添加劑用于生產保健品、藥品、功能飼料等，本文對于開發(fā)利用血橙皮多糖具有較好的參考價值。