汪建紅

（內(nèi)江師范學院化學化工學院，四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川內(nèi)江641110）

色素是一類重要的食品添加劑，在工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)、日常生活等領域有較為廣泛的應用。色素一般分為合成色素和天然色素兩類[1]。合成色素由于存在較多的負面作用，比如致癌等，因此應用受限[2-3]。天然色素主要源自動植物，無毒或低毒，且存在一些特殊的功能性，因此應用廣泛，尤其是在食品工業(yè)等領域[4-5]。荸薺皮作為荸薺副產(chǎn)物，含有較多的天然色素[6-8]。荸薺皮色素屬于黃酮類色素，具有消炎、抗衰老、抗氧化等作用[9-10]。中國的荸薺年產(chǎn)量可達百萬噸以上，而在加工和食用后被削下來的荸薺皮可占到荸薺鮮果總質(zhì)量的26%左右，因此開發(fā)利用荸薺皮色素具有得天獨厚的優(yōu)勢，可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟和社會價值，符合環(huán)保的社會理念，對于荸薺資源的綜合利用具有一定的意義[6]。

色素有諸多的提取方法，其中，有機溶劑直接浸提法[11-13]效率較低；酶法[14-15]后處理復雜，且酶易失活；超臨界二氧化碳法[16-17]所用設備較復雜，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。內(nèi)部沸騰法[18-19]、超聲波法[20-21]均具有操作簡便、快速高效省時等優(yōu)點，且內(nèi)部沸騰法的機理和超聲波的空化效應對色素提取的作用具有較好的一致性，均有利于色素從荸薺皮組織中解吸。超聲波輔助內(nèi)部沸騰法可使超聲波法的空化效應和內(nèi)部沸騰達到很好的協(xié)同，加快植物組織內(nèi)外的對流速度，提高提取效率，因此本文采用超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素，以期獲得較好的提取效果。此外，考察荸薺皮色素的穩(wěn)定性、抗氧化性等性能，可為其開發(fā)利用提供基本的參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑及材料

荸薺：市售；95%乙醇、無水乙醇、冰乙酸、乙酸鈉晶體、氫氧化鈉、鄰二氮菲、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵晶體、30%雙氧水（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；DFT-100型手提式萬能高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；BSA822型電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；SHBB95型水循環(huán)多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；T-6型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-3E型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 荸薺皮色素的提取和測定

參考文獻方法[22-23]，稱取1.00g荸薺皮粉末于100mL三頸瓶中，加入5 mL 95%乙醇，并在25℃左右溫度下浸泡30 min，然后加入不同溫度的50%乙醇溶液，迅速安裝好裝置，在約38 kPa壓力下和不同功率下進行超聲波處理，并在不同溫度下回流一定時間。冷卻后，離心獲取上清液，并過濾上清液。將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液定容。

用移液管從容量瓶中移取2.00 mL液體到比色管中，并用蒸餾水稀釋至10 mL。根據(jù)參考文獻數(shù)據(jù)[23]，在430 nm下測定稀釋后液體吸光度。根據(jù)朗伯-比爾定律，濃度和吸光度之間存在正相關的關系，因此本試驗利用測得的吸光度值大小來衡量提取的荸薺皮色素濃度大小。

2.2 單因素試驗

為了初步優(yōu)化荸薺皮色素的提取工藝條件，采用每一組固定液料比、功率、溫度和時間4個因素中3個因素，只改變其中1個因素的方法，先后研究液料比[15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、功率（160、200、240、280、320、360、400 W）、溫度（40、50、60、70、80 ℃）和時間（10、20、30、40、50 min）對色素提取效果的影響，重復2.1的操作步驟。

2.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇4個因素中影響相對顯著的3個因素，每個因素3個水平，以吸光度為響應值，設計響應面模型，并按照此模型安排試驗。

2.4 色素穩(wěn)定性測定

在響應面試驗得出的最佳條件下，按照2.1的方法獲得50 mL提取液，分別從提取液中移取2.00 mL溶液到 8 支比色管中，然后分別用 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸緩沖溶液稀釋到10 mL，25℃左右溫度下放置3 h，在430 nm波長下測定其吸光度值。

2.5 羥基自由基清除率的測定

在優(yōu)化后的最佳條件下，按照2.1的方法獲得50mL提取液， 分別從此提取液中移取 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL溶液到6支比色管中，分別用蒸餾水稀釋至10 mL，然后按照文獻方法[8，24]測定其對羥基自由基的清除率。

2.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本試驗的每組試驗條件均作了3次平行試驗，然后取其平均值。單因素試驗的結(jié)果采用origin 75軟件繪圖。響應面試驗采用Box-Behnken軟件設計模型，試驗結(jié)果采用Design Expert 8.0軟件分析處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 液料比的影響

液料比對荸薺皮色素吸光度的影響見圖1。

從圖 1 可看到，當液料比小于 45∶1（mL/g）時，荸薺皮色素吸光度隨液料比的增加而增加，在液料比45∶1（mL/g）時達到最大值；液料比超過 45∶1（mL/g）后，隨溶劑增多，吸光度逐漸減小。出現(xiàn)該變化的原因是：溶劑用量的增加會使能溶解的色素的量增加，但也會增加溶解浸出的脂溶性雜質(zhì)的量，脂溶性雜質(zhì)過多時會造成荸薺皮組織內(nèi)外對流通道的堵塞，進而影響色素的浸出[23]。 因此，選擇最佳液料比為45∶1（mL/g）。

圖1 液料比的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio

3.1.2 功率的影響

功率對荸薺皮色素吸光度的影響見圖2。

圖2 功率的影響Fig.2 Effect of power

從圖2可看到，當功率小于280 W時，色素吸光度隨功率增加而增大，最大值出現(xiàn)在280 W處；功率超過280 W后，隨功率增大，吸光度逐漸降低。出現(xiàn)該變化趨勢的原因是：功率的增大會使超聲波的空化效應等作用增強，這對色素提取來說是有利的；但功率過高時會使色素穩(wěn)定性下降，進而變質(zhì)，不利于色素提取[25]。因此，選擇最佳功率為280 W。

3.1.3 溫度的影響

溫度對荸薺皮色素吸光度的影響見圖3。

從圖3可看到，當溫度低于60℃時，隨溫度升高色素吸光度逐漸增大；當溫度高于60℃時，隨溫度升高色素吸光度逐漸減小。出現(xiàn)該變化趨勢的原因是：溫度的升高會使分子運動更活躍，內(nèi)部沸騰更劇烈，和超聲波空化效應協(xié)同起來對荸薺皮中未解吸的色素的沖擊作用更強，促進色素解吸進入溶液中，這對色素提取來說是有利的；但溫度過高時，分子運動的過分活躍會造成荸薺皮組織內(nèi)外對流通道的堵塞，過高的溫度還會使超聲波空化效應被一定程度削弱，影響色素浸出，同時也會導致溶劑的揮發(fā)量增加[25-28]。因此，選擇提取的最佳溫度為60℃。

圖3 溫度的影響Fig.3 Effect of temperature

3.1.4 時間的影響

時間對荸薺皮色素吸光度的影響見圖4。

圖4 時間的影響Fig.4 Effect of time

從圖4可看到，當時間小于20 min時，色素吸光度隨時間延長而逐漸增大，吸光度最大值出現(xiàn)在20 min處；超過20 min后，隨時間延長，吸光度逐漸降低。出現(xiàn)該變化趨勢的原因是：時間的延長能使荸薺皮中的色素更充分解吸并浸入溶液中，使組織內(nèi)外色素的濃度更趨于平衡；但時間過長時，在超聲波作用下已經(jīng)浸出的部分色素會發(fā)生分解變質(zhì)，也會導致更多的溶劑揮發(fā)，使已溶解的色素以固體形式重新析出。因此，選擇提取的最佳時間為20 min。

3.2 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，功率對色素提取的直接影響相對較小，因此選擇固定功率為280 W，以液料比（A）、溫度（B）、時間（C）為因素，以色素吸光度（R）為響應值，進行Box-Behnken響應面設計，因素水平如表1所示，試驗設計及結(jié)果如表2所示。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels in response surface experiments

表2 響應面試驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design arrangement and results

利用Design Expert 8.0軟件分析試驗結(jié)果得出模型的二次回歸方程為：R=0.91+0.032A-0.13B-0.087C-0.0055AB+0.032AC-0.12BC-0.021A2-0.14B2-0.068C2。

該擬合的二次模型的方差分析如表3所示，各因素交互作用的響應面圖和等高線如圖5～圖7所示。

圖5 液料比和溫度的等高線和響應面圖Fig.5 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and temperature

表3 擬合模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted model

從表3的方差分析可知，模型P＜0.000 1，影響高度顯著，失擬項P=0.467 9＞0.05，影響不顯著，說明使用該模型來優(yōu)化荸薺皮色素的提取工藝條件是合適的。該模型的R2=0.995 4，且變異系數(shù)C.V.%較低，為1.92%，說明該模型可靠性和精度較高。

一次項中A（液料比）、B（溫度）、C（時間）影響均高度顯著，交互項和二次項中，BC、B2、C2影響高度顯著，AC影響極顯著，A2影響顯著，AB影響不顯著，表明各影響因素和響應值不是簡單的線性關系。從F值還可看到各因素影響的主次順序為：B>C>A。

從圖5～圖7可看到3個因素彼此之間存在交互作用，對色素提取液吸光度的影響不是簡單的線性關系，從響應面圖的曲線可看到：溫度影響使曲線更陡峭，時間次之，液料比最為平緩，與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 液料比和時間的等高線和響應面圖Fig.6 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and time

圖7 溫度和時間的等高線和響應面圖Fig.7 Contour plot and response surface diagram of temperature and time

另外，利用Design Expert 8.0軟件還得出超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素的最佳工藝條件為：液料比 48.8∶1（mL/g），溫度 55.64 ℃和時間 19.09 min。考慮到試驗操作的實際情況，將該條件修正為：液料比 50∶1（mL/g），溫度 60 ℃，時間 20 min，該條件下的理論預測值為0.921。此條件下5次平行驗證試驗的平均值為0.911，相對標準偏差1.59%，與理論值0.921的相對偏差為-1.09%。

3.3 穩(wěn)定性試驗

pH值對荸薺皮色素吸光度的影響如表4所示。

表4 pH值對色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on stability of pigment

從表4可看到，相對于中性而言，酸性條件下色素提取液吸光度有一定程度的下降，堿性條件下提取液吸光度卻明顯增加。荸薺皮色素主要為黃酮類色素，黃酮的結(jié)構中存在大量的內(nèi)醚鍵和酚羥基，酸性條件下荸薺皮色素黃酮結(jié)構中的部分內(nèi)醚鍵發(fā)生了斷裂，使其顏色變?nèi)酰欢鴫A性條件下，黃酮結(jié)構中的酚羥基會轉(zhuǎn)化為氧負離子，使其供電子能力增強，從而產(chǎn)生增色效果。

3.4 羥基自由基清除率

對色素提取液進行不同程度稀釋后，所得溶液對羥基自由基清除率的測定結(jié)果如表5所示。

表5 色素對羥基自由基的清除率Table 5 Clearing rate of pigment for hydroxyl radical

從表5中可看到隨著溶液濃度增大，其對羥基自由基的清除率逐漸增大；當稀釋液濃度達到原提取液0.6倍時，清除率就已大于50%，未經(jīng)稀釋的原液的羥基自由基清除率甚至可達97.38%，說明荸薺皮色素的黃酮結(jié)構賦予了其較強的抗氧化活性。

4 結(jié)論

本試驗利用超聲波輔助內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮色素，根據(jù)單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化得出最佳提取工藝條件為：超聲波功率280 W，液料比 50∶1（mL/g），溫度60℃，時間20 min，該條件下的理論預測值為0.921。此條件下5次平行試驗的平均吸光度值為0.911（相對標準偏差為1.59%），與理論值0.921的相對偏差為-1.09%。

穩(wěn)定性試驗表明酸性條件下，色素吸光度有一定的下降；堿性條件下，色素吸光度有一定程度的增大?？寡趸钚匝芯勘砻?，色素濃度越高對羥基自由基的清除率越大，本試驗色素提取液對羥基自由基的清除率甚至可達97.38%，說明荸薺皮色素具有較強的抗氧化活性。這些結(jié)論為荸薺皮色素開發(fā)利用提供了一定的基本參考依據(jù)。