李晨晨

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

香椿又叫香椿頭，為楝科，香椿屬，是一種多年生落葉喬木，歷史悠久，在我國的多個省份都有分布[1]，葉子不易生蟲，具有特殊的香氣[2-3]，其營養(yǎng)素含量在蔬菜中位于首列[4]，是當(dāng)今較為理想的綠色食品之一。香椿具有抗氧化、防衰老、抑菌、清熱解毒、消炎化瘀、解除痙攣等多種生理功效[5-7]。目前香椿市場前景廣泛，種植香椿的農(nóng)戶越來越多，但是人們利用的大多是香椿嫩芽、嫩葉、香椿木等部位，對于香椿老葉等副產(chǎn)品總是作廢棄處理，造成了大量的資源浪費。一些研究結(jié)果表明，香椿老葉中含有一定量的黃酮類物質(zhì)[8]，這種物質(zhì)具有很高的應(yīng)用價值，首先黃酮可以有效清除體內(nèi)的自由基，具有抗氧化、抗衰老等作用，常常應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，深受消費者喜愛；其次，黃酮類化合物還具有降血糖[9]、降低膽固醇的功效，能夠促進(jìn)血液循環(huán)，對腫瘤[10-11]、心腦血管的發(fā)病率具有很好的抑制作用，除此之外，黃酮還可以提高機(jī)體免疫功能[12-13]，抑制細(xì)菌增長[14]，有效止痛、促進(jìn)傷口愈合等。因此，香椿老葉的開發(fā)和利用具有一定的應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安徽太和黑油椿、山東臨朐香椿、河南焦作香椿、安徽太和青油椿、山東煙臺西牟紅椿的老葉：采集于天津科技大學(xué)種植基地；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀、抗壞血酸（均為分析純）：天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；DPPH、ABTS：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.9%）：上海時代生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)（HK-02A）：廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；電子天平（ESJ205-4）：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；紫外可見分光光度計（SP-2102UV）：上海光譜儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ－400KDB）：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；臺式離心機(jī)（TDL-5-A）：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋（HWS26）：上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮提取液制備

取香椿老葉作為樣品材料，曬干，粉碎機(jī)粉碎；取1 g香椿老葉粉末與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合，超聲一定時間，同時設(shè)置一定的溫度；將上述溶液在4 800 r/min的離心機(jī)中離心20 min，離心完畢后，將上清液置于100 mL容量瓶中待用；濾渣再加入一定量的乙醇，同樣用超聲波進(jìn)行輔助提取，重復(fù)上述步驟，合并兩次濾液，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇稀釋至容量瓶刻度，得到黃酮提取液[15]。

1.3.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照趙艷霞等[16]制作黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法并作些許改動，準(zhǔn)確稱量10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，將其放入100 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶液溶解并進(jìn)行定容，最終得到0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液；準(zhǔn)備11個10 mL的容量瓶， 分別吸取 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10mL容量瓶中；分別加入1 mL 10 g/L亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1 mL 20 g/L硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入2 mL 4 g/L氫氧化鈉溶液，用60%乙醇定容，搖勻，靜置12 min；以不添加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的試劑作為空白對照，在510 nm處測定不同溶液的吸光度；最后以蘆丁溶液濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 黃酮含量測定及提取率計算

用移液槍吸取1 mL黃酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.2方法步驟進(jìn)行操作，最后對香椿老葉中黃酮的提取率進(jìn)行計算。

式中：W為回歸方程中對應(yīng)的蘆丁濃度，mg/mL；V為溶液反應(yīng)的體積，mL；X為黃酮提取液總體積，mL；m為稱取的香椿老葉粉末的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

參照劉玉梅等[17]的方法設(shè)置4個因素，乙醇體積分?jǐn)?shù) 40%、50%、60%、70%，料液比 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），超聲溫度 40、50、60、70 ℃，超聲時間 30、40、50、60 min，分別按各因素不同梯度進(jìn)行單因素試驗，考察不同因素對黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗

參照李思陽等[18]的方法選擇單因素試驗中的4個因素3個水平，以黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗，每組試驗3個重復(fù)，最后取平均值作為最終結(jié)果，試驗因素水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平Table 1L9（34）orthogonal test factor and level

1.3.6 不同時期、不同品種香椿老葉黃酮含量比較

分別取不同時期（10月、11月、12月）、不同品種的香椿老葉（黑油椿、青油椿、臨朐香椿、西牟紅椿、焦作香椿）曬干，粉碎機(jī)粉碎。分別稱取1 g香椿老葉粉末于錐形瓶中，根據(jù)單因素和正交試驗得出的最佳提取條件進(jìn)行提取，再將提取液于4 800 r/min離心20 min，將上清液置于100 mL容量瓶中，濾渣重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，并分別用60%的乙醇溶液定容至容量瓶刻度線，得到黃酮提取液。取1 mL提取液，按照制作黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟，分別測定不同品種香椿老葉的黃酮含量，并進(jìn)行比較。

1.3.7 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除率測定：參照王曉敏等[19]方法，首先吸取1.5 mL不同濃度的黃酮提取液（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL）于試管中，向上述 10 個試管中分別加入1.5 mL濃度為0.1 mg/mL的DPPH溶液，于25℃避光反應(yīng)30 min，最后用分光光度計于517 nm處測定溶液吸光度。陽性對照選取VC溶液。

式中：A0為蒸餾水+DPPH溶液的吸光度；A1為黃酮提取液+DPPH溶液的吸光度；A2為蒸餾水+黃酮提取液的吸光度。

ABTS+自由基清除率測定：參照李培源等[20]的方法，分別量取 1.5 mL 濃度分別為 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的黃酮提取液于試管中，取1.5 mL的ABTS溶液加入到上述溶液中，25℃避光反應(yīng)6 min，于波長734 nm下測定其吸光度，其中對照溶液為1.5 mL黃酮提取液和1.5 mL ABTS溶液，空白溶液為1.5 mL蒸餾水和1.5 mL ABTS溶液。

式中：A0為蒸餾水+ABTS溶液的吸光度；A1為黃酮提取液+ABTS溶液的吸光度；A2為黃酮提取液+蒸餾水的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

回歸方程為y=10.033x-0.018 8，R2=0.994 8，根據(jù)回歸方程計算香椿老葉的黃酮含量。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響見圖2。

由圖2可看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時，黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時提取率達(dá)到最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%后，提取率降低，這可能是由于過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解出了香椿老葉內(nèi)的其它物質(zhì)，影響了黃酮的顯色反應(yīng)[21]，因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of flavonoids

2.2.2 料液比對黃酮提取率的影響

料液比對黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對黃酮提取率的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

由圖3可看出，黃酮提取率在料液比為1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）范圍內(nèi)隨溶劑體積增大而增大，但是在1∶30（g/mL）～1∶35（g/mL）范圍內(nèi)增長不明顯，因此在節(jié)約試劑的原則下，選擇料液比1∶30（g/mL）為最佳。

2.2.3 超聲溫度對黃酮提取率的影響

超聲溫度對黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4可看出，當(dāng)超聲溫度為40℃～50℃時，黃酮提取率隨溫度的升高而增大，在溫度為50℃時提取率達(dá)到最高，當(dāng)超聲溫度高于50℃時，黃酮提取率反而降低，這可能是由于溫度過高，導(dǎo)致黃酮分解，從而使黃酮提取率降低[22]。因此，選擇超聲溫度50℃為最佳。

圖4 超聲溫度對黃酮提取率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2.4 超聲時間對黃酮提取率的影響

超聲時間對黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對黃酮提取率的影響Fig.5 Influence of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids

由圖5可看出，當(dāng)超聲時間在30 min～40 min范圍內(nèi)，黃酮提取率隨時間的延長而增加，40 min時提取率達(dá)到最高，但是當(dāng)超聲時間超過40 min后，黃酮的提取率反而不斷下降，這可能是由于長時間暴露在外面，黃酮類化合物被氧化分解[23]，因此，選擇超聲時間40 min為最佳。

2.3 正交試驗結(jié)果

依據(jù)2.2單因素試驗結(jié)果，以黃酮提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 L9（34）黃酮提取率正交試驗結(jié)果Table 2L9（34）orthogonal experimental results of extraction rate of flavonoids

續(xù)表2 L9（34）黃酮提取率正交試驗結(jié)果Continue table 2L9（34）orthogonal experimental results of extraction rate of flavonoids

由表2可看出4個因素對香椿老葉內(nèi)黃酮提取率的影響大小為A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞B（料液比）＞D（超聲溫度）＞C（超聲時間），優(yōu)化的提取工藝條件為A2B2C2D1。為了驗證試驗結(jié)果的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗證試驗，所得的黃酮提取率分別為3.92%、3.99%、4.05%，均大于正交試驗中任何一組的提取率，因此，確定黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶30（g/mL），超聲溫度 40 ℃，超聲時間 40 min。

2.4 黃酮含量比較

黃酮含量比較見圖6。

圖6 黃酮含量比較Fig.6 Comparison of flavonoid content

由圖6可以看出，從10月到12月，5種香椿老葉的黃酮含量都有所增加，尤其是在10月至11月，山東臨朐香椿的老葉中黃酮增長量較為顯著，增長了2.98%，但是在11月至12月，臨朐香椿老葉中黃酮含量增長較為緩慢，只增長了0.02%。在11月至12月，安徽太和的青油椿老葉中黃酮增長量較為明顯，增長了1.09%，且在12月份，青油椿老葉中的黃酮含量最高，達(dá)到了6.45%。

2.5 抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除率結(jié)果比較

DPPH自由基清除率結(jié)果比較見圖7。

通過圖7可以得出隨著5種香椿老葉黃酮提取液濃度的增加，DPPH自由基清除率都在增加，最后趨于平緩。并且可以看出VC的DPPH自由基清除率最高，5種香椿老葉中，青油椿清除自由基的能力最高，其次為臨朐香椿，焦作香椿、黑油椿兩種香椿自由基清除能力相差不多，西牟紅椿的清除能力最低。由此可以得出：青油椿的抗氧化能力最高，這與不同香椿品種抗氧化物質(zhì)含量比較的試驗中，青油椿的含量最高這一結(jié)果相一致，再一次證明黃酮含量越高，自由基清除能力越高。

圖7 DPPH自由基清除率比較Fig.7 Comparison of DPPH free radical scavenging rate

2.5.2 ABTS+自由基清除率結(jié)果比較

ABTS+自由基清除率結(jié)果比較見圖8。

圖8 ABTS+自由基清除率結(jié)果比較Fig.8 Comparison of ABTS+free radical scavenging rate

由圖8可以得出隨著5種香椿提取液濃度的增加，ABTS+自由基清除率都在增加，最后趨于平緩，且VC的ABTS+自由基的清除率最高，這與DPPH自由基清除率試驗結(jié)果相似。在5種香椿老葉中，來自安徽太和的青油椿，對ABTS+自由基的清除率最高，即青油椿抗氧化能力最強(qiáng)。其余4種香椿的抗氧化能力相差不多。綜上，隨著黃酮濃度的增加，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率均隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。并且來自安徽太和的青油椿抗氧化能力最高。

3 結(jié)論

本試驗對香椿老葉中黃酮的最佳提取條件進(jìn)行了研究，結(jié)果為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶30（g/mL），超聲溫度40℃，超聲時間40 min。在最佳提取條件下，分別對不同時期（10月、11月、12月）、不同品種（黑油椿、青油椿、焦作香椿、臨朐香椿、西牟紅椿）香椿老葉內(nèi)黃酮含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明：從10月份到12月份，5種香椿老葉中的黃酮含量均有所增長，均在12月份達(dá)到最高含量，且在12月份，來自安徽太和的青油椿黃酮含量最高。黃酮含量比較顯示：在10月至11月，山東臨朐香椿的增長量較為顯著，在11月至12月，安徽太和的青油椿黃酮增長量較為明顯?？寡趸Y(jié)果表明：隨著黃酮濃度增加，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率也在逐步增大，具有一定的量效關(guān)系，且青油椿的抗氧化能力最高。