王申，張舜華，薛薇，王鵬飛，任格，陳傳軍

高血壓是一種嚴(yán)重危害人類健康水平的多發(fā)病，它主要是由于遺傳基因和生活環(huán)境共同引起的。血壓水平與心腦血管病發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)之間存在密切的因果關(guān)系，血壓水平與心力衰竭、心房顫動(dòng)、終末期腎病發(fā)生也存在因果關(guān)系。它不僅給患者帶來了嚴(yán)重生理傷害，且給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。中國高血壓調(diào)查最新數(shù)據(jù)顯示[1]。2012～2015年我國18歲及以上居民高血壓患病粗率為27.9%，我國高血壓患者的知曉率、治療率和控制率近年明顯提高，但總體仍處于較低水平，分別達(dá)51.6%、45.8%和16.8%。由于高血壓受遺傳基因的影響，因此，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者開始將與高血壓相關(guān)的敏感基因作為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)，與疾病相關(guān)的易感基因在個(gè)體內(nèi)差異很大[1]。接受藥物治療的患者中20%～50%血壓未得到良好控制。研究表明藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體（藥物作用靶點(diǎn)）的遺傳變異是造成個(gè)體藥物反應(yīng)差異的主要原因。有研究表明CYP2C9是導(dǎo)致氯沙坦氧化的主要P450同工酶，CYP2C9基因型變異導(dǎo)致了氯沙坦氧化和活化的個(gè)體間差異[2]。本研究通過研究影響沙坦類抗高血壓藥物代謝CYP2C9*3基因的頻率差異，評(píng)估這些基因的遺傳變異在高血壓患者的分布特征，為進(jìn)一步指導(dǎo)高血壓病的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組本實(shí)驗(yàn)選取2018年～2019年就診于北京大學(xué)航天中心醫(yī)院全院的原發(fā)性高血壓患者1236例，其中男性684例，女性552例，年齡45～76（63±8）歲。高血壓納入標(biāo)準(zhǔn)（2018年中國高血壓防治指南）：收縮壓（SBP）≥140 mmHg，舒張壓（DBP）≥90 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）；排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓；肝腎功能不全；明顯心功能不全、糖尿病及嚴(yán)重心腦血管疾病等。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集方法本實(shí)驗(yàn)按照世界衛(wèi)生組織（WHO）、聯(lián)合國教科文組織（UNESCO）生物倫理委員會(huì)（IBO）等有關(guān)《關(guān)于DNA取樣、控制和獲得的聲明》的要求，簽訂“知情同意”收集高血壓的血樣。采用EDTA抗凝的真空采血管，抽取受檢者外周靜脈血3～5 ml，使用天根生化科技（北京）有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）DP304提取基因組DNA。

1.2.2 DNA制備吸取20 μl蛋白酶K至1.5 ml離心管的底部；加入200 μl待提取基因組的樣品至離心管中；加入200 μl Buffer GB至樣品中，渦旋振蕩15 s混勻；完全混勻以得到均一化的溶液對(duì)于保證樣品的充分裂解很重要；70℃孵育10 min。DNA得率在該條件下已經(jīng)達(dá)到最大值，延長孵育時(shí)間不會(huì)進(jìn)一步提高得率；快速離心，去除殘留在1.5 ml離心管蓋子中的液滴；加入200 μl（樣品等體積）的無水乙醇，渦旋振蕩15 s混勻。振蕩完畢后，快速離心，去除殘留在1.5 ml離心管蓋子中的液滴；將得到的混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），扣上蓋子12 000 rpm，離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復(fù)操作上一步驟；將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 rpm（～134 00×g）離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μl（建議70 μl）洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）離心 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.3 CYP2C9＊3基因型檢測使用無錫銳奇基因生物科技有限公司的CYP2C9*3檢測試劑盒（PCR-熔解曲線法）在Gentier 96E全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（西安天隆科技有限公司）進(jìn)行PCR熔解曲線分析。按一定順序向配制好的PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑中分別加入2 μl提取好的核酸、陰陽性對(duì)照品。做好標(biāo)記，蓋緊反應(yīng)管，2000 rpm離心10 sec后進(jìn)行PCR熔解曲線分析。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入94℃變性30 s，56℃復(fù)性32 s，72℃延伸30 s循環(huán)，共50個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入熔解階段，設(shè)置46～75℃，每個(gè)溫度收集熒光，熒光檢測通道選擇FAM和ROX。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。群體遺傳平衡運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡定律。兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用頻數(shù)（百分?jǐn)?shù)）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C9＊3（c.1075A＞C）基因多態(tài)性結(jié)果分析1236例高血壓藥物治療的患者中，針對(duì)其CYP2C9*3（c.1075A＞C）基因位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測，通過分析比較所產(chǎn)生的熔解曲線Tm值的變化，進(jìn)行SNP分型。只出現(xiàn)1個(gè)熔解峰時(shí)為純合型（包括野生純合、突變純合），同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)峰時(shí)為雜合型（圖1）。

圖1 CYP2C9*3 c.1075 A＞C位點(diǎn)基因型熔解曲線峰圖

只出現(xiàn)1個(gè)低Tm值熔解峰的樣本，CYP2C9*3 c.1075 A＞C位點(diǎn)為野生型純合子（A/A），出現(xiàn)2個(gè)Tm值熔解峰的樣本為突變型雜合子（A/C），只出現(xiàn)1個(gè)高Tm值熔解峰的樣本為突變型純合子（C/C）（表1）。

表1 CYP2C9*3 c.1075 A＞C位點(diǎn)基因型

2.2 高血壓患者CYP2C9＊3不同基因型、等位基因頻率分布情況1236例高血壓患者中，發(fā)現(xiàn)CC基因型5例，高血壓組中的等位基因A的頻率為95.11%，等位基因C為4.89%，高于國人健康人群中的發(fā)生頻率（表2）。

表2 北京地區(qū)1236例高血壓患者CYP2C9*3不同基因型、等位基因頻率分布情況

2.3 不同性別間高血壓組CYP2C9＊3基因型、等位基因頻率分布情況AA、AC+CC基因型以及等位基因A與C的發(fā)生頻率間在性別間的差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 不同性別間高血壓組CYP2C9*3基因型、等位基因頻率分布情況

2.4 不同年齡組間高血壓組CYP2C9＊3基因型、等位基因頻率分布情況根據(jù)年齡分為青中老年（≤64歲）、老年組（≥65歲）分為2組，得出青中老年（≤64歲）、老年組（≥65歲）間CYP2C9*3基因型、等位基因發(fā)生頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表4 不同年齡組之間高血壓組CYP2C9*3基因型、等位基因頻率分布情況

3 討論

CYP2C9位于人體常染色體10q24.2上，總長大約55 kb，其中含有8個(gè)內(nèi)含子，9個(gè)外顯子，CYP2C9基因編碼有490個(gè)氨基酸、其編碼蛋白質(zhì)分子量約為55kD。CYP2C9*3基因突變，它是在CYP2C9第7號(hào)外顯子的第1075位置，堿基A突變?yōu)閴A基C，導(dǎo)致在其編碼的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的第359位置上，異亮氨酸（ILe）被亮氨酸（Leu）所取代。CYP2C9的等位基因目前發(fā)現(xiàn)有10多種，其基因型發(fā)生改變有可能會(huì)導(dǎo)致該基因表達(dá)的酶活性發(fā)生根本變化。因此CYP2C9基因發(fā)生突變就可能引起CYP2C9酶的空間結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生根本改變，最終會(huì)致使CYP2C9酶活性出現(xiàn)下降甚至喪失，所以就會(huì)造成對(duì)其底物的代謝清除能力發(fā)生根本變化。CYP450酶系作為多數(shù)藥物的代謝酶，其存在高度多態(tài)性，基因位點(diǎn)突變則可能導(dǎo)致該酶的活性變化。經(jīng)CYP2C9酶代謝的抗高血壓藥物有血管緊張素受體拮抗藥，常見的如氯沙坦、厄貝沙坦等，研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9基因多態(tài)性不僅會(huì)降低氯沙坦等治療高血壓的療效，而且還會(huì)影響與它種藥物聯(lián)合使用的效果[3,4]。本文對(duì)近2年就診于我院的高血壓人群及的 CYP2C9*3基因多態(tài)性分布頻率及其與高血壓的關(guān)系進(jìn)行了分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，在1236名高血壓患者中，發(fā)現(xiàn)CC基因型患者5例，等位基因C在高血壓患者中的發(fā)生率為4.89%，在不同性別及年齡間的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。雖然女性等位基因C的發(fā)生率（1.98%）低于男性等位基因C的發(fā)生率（2.91%），但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，提示對(duì)攜帶CYP2C9*3的高血壓患者在服用沙坦類降壓藥物時(shí)，應(yīng)重視由CYP2C9*3突變而造成降壓類藥物療效降低的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)減少用藥劑量。

國外研究得出CYP2C9*3的等位基因頻率在非洲裔美國人和亞洲人中分別為1.0%～3.6%和0.5%～1.5%[5,6]。Craig R Lee等研究得出白種人的CYP2C9 *1/*3的發(fā)生率在11.6%，CYP2C9 *3/*3為0.4%，CYP2C9 *1/*1的發(fā)生率在65.3%[7]。國內(nèi)研究得出CYP2C9*3中的等位基因C的頻率在1.6%～3.2%，與正常非高血壓人群相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)的研究中都未發(fā)現(xiàn)CYP2C9 *3/*3突變純合子型（CC型），考慮入組患者人數(shù)少有關(guān)[8.9]。而我們?cè)?236名高血壓患者中發(fā)現(xiàn)5例CYP2C9 *3/*3突變純合子型（CC型）患者，考慮為入組人群數(shù)量大相關(guān)。

Yu等[5]對(duì)湖南長沙地區(qū)的239例高血壓人群和265例正常人群進(jìn)行了CYP2C9*3檢測后發(fā)現(xiàn)，高血壓人群中女性攜帶CYP2C9*3 的頻率低于正常人群，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01，并認(rèn)為攜帶CYP2C9*3的女性可能是高血壓病的保護(hù)性因子，且在既往的研究中也報(bào)道過CYP酶存在性別的差異[10,11]。在我們的研究中，女性高血壓組中CYP2C9*3攜帶者比例低于男性高血壓患者以及文獻(xiàn)報(bào)道的正常人群，這可能由于入選的女性患者較少于男性患者有關(guān)，另外國外Donner等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)CYP2C9*3攜帶者在高血壓男性患者中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS系統(tǒng)）活性較低，在原發(fā)性高血壓男性中，CYP2C9*3對(duì)氯沙坦的抗高血壓的效應(yīng)沒有影響。CYP2C9*3的存在與需要更高劑量的氯沙坦有關(guān)，這是由于氯沙坦向其活性產(chǎn)物E-3174的轉(zhuǎn)化率有一定程度的降低[15]?；趪鴥?nèi)外研究，針對(duì)性別間的差異可為藥物治療提供了有用的指導(dǎo)價(jià)值，至于性別間藥物劑量等詳細(xì)數(shù)據(jù)仍需進(jìn)一步的研究。

本研究首次檢測了北京地區(qū)高血壓人群與高血壓病藥物治療及代謝相關(guān)的CYP2C9*3基因位點(diǎn)的多態(tài)性，對(duì)于高血壓病的個(gè)體化治療提供了基礎(chǔ)的指導(dǎo)意義。在臨床工作中，對(duì)于攜帶CYP2C9*3等位基因的患者，在使用沙坦類藥物時(shí)由于其酶活的減弱，對(duì)底物的代謝作用也可能減弱導(dǎo)致血藥濃度增加，藥物作用時(shí)間加長，故應(yīng)減少用藥劑量，減少用藥頻率，從而降低不良反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)于CYP2C9 *3/*3純合子（CC型）的高血壓患者，因?qū)ι程诡愃幬锏拇x作用很弱，建議換用其它適用的降壓藥物[16]。對(duì)于CYP2C9*3基因位點(diǎn)不同基因型的高血壓患者服用沙坦類降壓前后的對(duì)比差異，我們?cè)诤罄m(xù)文章會(huì)進(jìn)一步做回顧性分析。