白婷婷，祁華琪，聶曉東

急性心肌梗死（AMI）多由動(dòng)脈粥樣硬化所形成的血栓而引起心肌缺血性壞死，從而導(dǎo)致具有極大致死性的急性病癥[1]。因此AMI的早期診斷和治療對(duì)于保護(hù)心臟功能尤為重要。AMI常伴眩暈，耳鳴、嘔吐、昏迷不醒等癥狀，嚴(yán)重威脅人們生命健康[2]。

腫瘤壞死因子受體超家族成員9（CD137）是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，在自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)促炎因子的分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。微小RNA（miRNA）是一個(gè)非編碼核糖核酸家族，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞自我更新、發(fā)育、分化、生長(zhǎng)和代謝中起重要調(diào)控作用[4]。有研究表明，多種miRNA與動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊形成有關(guān)，可作為其生物標(biāo)志物，且在冠心病發(fā)生中起重要調(diào)控作用[5,6]。微小RNA-335-5p（miR-335-5p）作為miRNA家族成員之一，具有作為AMI生物標(biāo)志物的潛能。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-335-5p和CD137在AMI患者血清中的表達(dá)情況，探討兩者對(duì)AMI的影響及與預(yù)后關(guān)系，以期為AMI發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究選取2015年3月～2017年6月于河南省第二人民醫(yī)院已確診收治的發(fā)病短期內(nèi)就醫(yī)的85例AMI患者，平均年齡（50.37±18.26）歲；其中男性45例，女性40例，均符合AMI納入標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組包括73例健康者，平均年齡（48.31±15.08）歲；其中男性39例，女性34例。納入標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病時(shí)間＜2 h并符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)；資料完備。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他心臟疾病或近期行手術(shù)等相關(guān)治療。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和對(duì)照組均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)主要試劑：UltraSYBR Mixture（Low ROX）（貨號(hào)：CW0956，購(gòu)自康為世紀(jì)公司）；RNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP441，購(gòu)自北京天根生化有限公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix（貨號(hào)：RR047AA，購(gòu)自日本Takara公司）。人心肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒（貨號(hào)：KL00503，購(gòu)自南上?？道噬锟萍加邢薰荆籆D137 ELISA試劑盒（貨號(hào)：1535473809，購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司）；MyO ELISA試劑盒（貨號(hào)：YEF10701，購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司）。本實(shí)驗(yàn)主要儀器：高速低溫離心機(jī)（JW-3021HR，購(gòu)自嘉文設(shè)備有限公司）；熒光定量PCR儀（LightCycler?96）購(gòu)自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（RT2100C）購(gòu)自德國(guó)IFP公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存AMI患者在入院時(shí)和發(fā)病4 h和8 h時(shí)抽取靜脈血4 ml；對(duì)照組清晨空腹抽取靜脈血4 ml，2500 rpm離心10 min后收集血清于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 qRT-PCR法檢測(cè)血清中mir-335-5p表達(dá)水平使用RNA提取試劑盒（天根）提取出血清中總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA（反應(yīng)體系如下所示）。以此為模板，采用qRT-PCR檢測(cè)血清中mir-335-5p的表達(dá)水平（反應(yīng)體系如下所示）。用U6作為內(nèi)參對(duì)mRNA標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)2-△△Ct分析mir-335-5p的表達(dá)。用Primer 6.0和Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物（引物長(zhǎng)度為18～22bp，擴(kuò)增長(zhǎng)度100～300bp，表1），送華大基因進(jìn)行合成，經(jīng)10倍稀釋備用。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Total RNA（1000/c）；RNase Free dH2O（up to 20 μl）；Mix（4 μl）。

PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.25 μl；ddH2O 5 μl；Primer-F 0.5 μl；Primer-R 0.5 μl；2×Taq PCR master mix 6.25 μl。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)血清中CD137、肌鈣蛋白I（cTnI）、肌紅蛋白（MyO）的表達(dá)水平根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)所有研究對(duì)象血清中CD137、cTnI和MyO蛋白表達(dá)水平。

1.4 隨訪隨訪3年，從術(shù)后為隨訪開(kāi)始時(shí)間，死亡患者以死亡時(shí)間為隨訪截止日期，生存患者至3年期滿結(jié)束，以電話、復(fù)查等方式登記患者生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料表示形式采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。兩個(gè)獨(dú)立樣本之間采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析CD137、mir-335-5p與cTnI、MyO表達(dá)水平的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier曲線分析 CD137、mir-335-5p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較兩組患者的年齡、性別、飲酒史、高血壓史和吸煙史、糖尿病史和高血脂病史等基本資料之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表2。

表2 兩組基本資料的比較

2.2 血清中CD137、mir-335-5p、cTnI和MyO水平檢測(cè)情況由結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，入院時(shí)AMI組CD137、cTnI和MyO水平顯著增加（P＜0.05），而mir-335-5p表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）；與入院時(shí)相比，在發(fā)病4 h和8 h時(shí)AMI組患者血清中cTnI、MyO、CD137水平顯著增加，而mir-335-5p表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05）；在發(fā)病8 h時(shí)，AMI組患者血清中cTnI、MyO、CD137水平與4 h時(shí)相比顯著增加，而mir-335-5p表達(dá)水平則顯著降低（P＜0.05），表3。

表3 血清中CD137、mir-335-5p、cTnI和Mb的表達(dá)水平

2.3 AMI患者血清中CD137、mir-335-5p與cTnI、MyO表達(dá)水平的相關(guān)性Pearson法分析發(fā)現(xiàn)，AMI患者血清中CD137與cTnI、MyO表達(dá)均呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.778、0.555，P＜0.05），圖1～2。AMI患者血清中mir-335-5p與cTnI、MyO表達(dá)均呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.506、-0.617，P＜0.05），圖3～4。

圖1 AMI患者血清中CD137與cTnI表達(dá)相關(guān)性分析

圖3 AMI患者血清中mir-335-5p與cTnI表達(dá)相關(guān)性分析

2.5 血清中CD137、mir-335-5p表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系在3年隨訪中發(fā)現(xiàn)，85例患者中生存60例，死亡25例，生存為70.59%。將AMI患者以CD137、mir-335-5p表達(dá)的中位數(shù)分為兩組，大于中位數(shù)為高表達(dá)組，小于中位數(shù)為低表達(dá)組。CD137低表達(dá)患者生存率為83.33%，而高表達(dá)組生存率為58.14%，兩組比較logrank值為6.397，P=0.011；mir-335-5p高表達(dá)組生存率為77.27%，低表達(dá)組生存率為63.41%，兩組比較logrank值為3.157，P=0.046，圖5～6。

圖2 AMI患者血清中CD137與MyO表達(dá)相關(guān)性分析

圖4 AMI患者血清中mir-335-5p與MyO表達(dá)相關(guān)性分析

圖5 CD137表達(dá)與AMI患者預(yù)后生存的關(guān)系

3 討論

AMI是現(xiàn)今最常見(jiàn)的疾病之一，有許多誘發(fā)因素如：飲酒過(guò)量、激動(dòng)過(guò)度、吸煙等，而隨著飲食的改變和快速的生活節(jié)奏，AMI的發(fā)病率逐年增加，其中大約50%的患者是亞洲人種，目前與其相關(guān)的研究雖逐漸增加，但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的數(shù)據(jù)資料仍嚴(yán)重缺乏[7,8]。AMI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，有研究表明炎癥因子與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，在冠心病發(fā)生過(guò)程中，炎癥反應(yīng)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成有直接關(guān)系[9,10]。有研究表明，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等促炎因子表達(dá)增加可對(duì)血管內(nèi)皮造成嚴(yán)重?fù)p傷[11,12]。還有研究表明，AMI發(fā)病時(shí)，cTnI、MyO等標(biāo)志物異常表達(dá)，可作為AMI早期診斷指標(biāo)[13,14]。此前，關(guān)于miR-335-5p和CD137表達(dá)水平與AMI相關(guān)性以及預(yù)后關(guān)系的研究還未被探討過(guò)，因此本研究通過(guò)檢測(cè)miR-335-5p和CD137在AMI患者血清中的表達(dá)情況，探討兩者對(duì)AMI的影響以及與預(yù)后的關(guān)系。

圖6 mir-335-5p表達(dá)與AMI患者預(yù)后生存的關(guān)系

近期有研究表明，miRNA能夠通過(guò)調(diào)控多種基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能，參與血管生成，并且可發(fā)揮抗纖維化作用[15,16]。劉志立等[17]發(fā)現(xiàn)血清中miR-29b、miR-424的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)度發(fā)生，導(dǎo)致血管損傷并造成心肌缺血從而致使AMI的發(fā)生。袁梅等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺血性腦卒中患者血清中miR-335表達(dá)降低，這表明miR-335有成為AIS診斷及預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)的潛能。該結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相似：本研究中，與對(duì)照組相比，AMI患者血清中mir-335-5p表達(dá)水平顯著降低，并且隨著發(fā)病時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)水平持續(xù)降低，這表明mir-335-5p可用于跟蹤病情發(fā)展?fàn)顩r。Pearson法分析發(fā)現(xiàn)，mir-335-5p與cTnI、MyO表達(dá)均呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明mir-335-5p可能與cTnI、MyO相互影響，從而參與AMI的發(fā)生發(fā)展；此外，在為期3年的預(yù)后隨訪中發(fā)現(xiàn)，mir-335-5p高表達(dá)患者預(yù)后生存率高于低表達(dá)者，這表明mir-335-5p水平可能對(duì)預(yù)測(cè)AMI患者預(yù)后有一定價(jià)值。因此mir-335-5p可作為AMI早期監(jiān)測(cè)和預(yù)后情況判斷的檢測(cè)指標(biāo)。

CD137是腫瘤壞死因子家族之一，主要在活化的T淋巴細(xì)胞CD8+中表達(dá)，而CD8+與斑塊的增加有密切相關(guān)性，并且可增加心血管疾病的發(fā)生[19]。有研究表明CD137能夠促進(jìn)斑塊形成及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20]。在血清中能夠以可溶形式sCD137存在。王寧等[21]研究發(fā)現(xiàn)激活CD137信號(hào)通路可促使血管平滑肌細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣斑塊發(fā)生鈣化。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)AMI患者血清中CD137、cTnI、MyO表達(dá)水平顯著上調(diào)；并隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)在4～8 h內(nèi)持續(xù)增加，這表明CD137可能參與AMI患者的疾病進(jìn)展。Pearson法分析發(fā)現(xiàn)，AMI患者血清中CD137與cTnI、MyO表達(dá)均呈明顯正相關(guān)關(guān)系，表明三者間可能存在某種相關(guān)機(jī)制共同參與AMI的發(fā)生；此外，在為期3年的預(yù)后隨訪中發(fā)現(xiàn)，CD137低表達(dá)患者預(yù)后生存率高于CD137高表達(dá)者，這表明CD137可作為AMI疾病發(fā)生發(fā)展和預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，AMI患者血清中CD137表達(dá)水平顯著增加，而mir-335-5p表達(dá)水平則顯著降低；此外，CD137低表達(dá)和mir-335-5p高表達(dá)患者預(yù)后生存率更高。表明兩者參與AMI的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，其表達(dá)水平可作為檢測(cè)AMI發(fā)病的重要參照指標(biāo)，且可用于判斷患者預(yù)后情況，具有作為AMI診斷生物標(biāo)志物的潛能。