黃寅，徐通潔，劉朝林，劉勇

糖尿病作為全球公認(rèn)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，其在中國的嚴(yán)峻形勢也不容忽視，糖尿病血管并發(fā)癥是近年來糖尿病患者致殘、致死率不斷上升的主要原因[1]。其中，糖尿病血管鈣化被認(rèn)為是一個(gè)主要獨(dú)立危險(xiǎn)因子，在糖尿病患者心血管疾病發(fā)生發(fā)展中占重要作用[2-4]。

機(jī)體在持續(xù)高血糖狀態(tài)下會(huì)形成一種穩(wěn)定不可逆的終產(chǎn)物，即晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），伴隨在糖尿病患者體內(nèi)的異常積累，AGEs通過參與腎臟病變、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜疾病等病變導(dǎo)致一系列糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和惡化[5,6]。前期研究也發(fā)現(xiàn)AGEs能通過結(jié)合人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）膜上的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）激活相關(guān)通路，上調(diào)鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)鈣化的發(fā)生發(fā)展[7]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，沒有明顯的蛋白質(zhì)編碼功能[8]。目前發(fā)現(xiàn)lncRNA能通過合成位點(diǎn)局部調(diào)節(jié)、遠(yuǎn)端染色體相互作用、靶向特定基因組等不同模式參與細(xì)胞內(nèi)各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程[9]。LncRNA通過調(diào)控血管細(xì)胞的表型、凋亡、遷移、自噬和增殖等過程，參與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病微血管病變、心肌肥厚、心肌梗死等病理過程，進(jìn)而在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[10-14]。LncRNA發(fā)揮的生物學(xué)功能不僅可作為診斷血管疾病的生物學(xué)指標(biāo)，更可能是血管疾病臨床治療的新方向。然而lncRNA在糖尿病血管鈣化中的作用機(jī)制仍不清楚。本研究旨在通過高糖產(chǎn)物構(gòu)建細(xì)胞鈣化模型，通過基因芯片技術(shù)篩選出與糖尿病動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化有關(guān)的lncRNA，并對(duì)相關(guān)lncRNA參與血管平滑肌鈣化的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測和初步驗(yàn)證，為糖尿病血管病變的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和臨床治療提供參考方向。

1 材料和方法

1.1 材料正常HASMCs原代細(xì)胞購自美國ScienCell公司。平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（SMCM）購自美國ScienCell公司；AGEs BSA購自日本Biovision；BCA 蛋白定量試劑盒購自武漢碧云天生物技術(shù)公司；一抗二抗稀釋液購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；β-actin、OPG、RUNX2、COX2兔抗人一抗、熒光二抗均購自英國Abcam；lncRNA Smart Silencer抑制試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購于成都福際公司；熒光定量PCR試劑盒購于德國Qiagen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本東洋紡公司；引物設(shè)計(jì)及合成購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HASMCs培養(yǎng)和干預(yù)將HASMCs原代細(xì)胞復(fù)蘇后于37℃、5%CO2培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，取第5～8代平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白表達(dá)的測定使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣本每孔定量通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白在400 mA恒流下濕轉(zhuǎn)60 min至PVDF膜上，然后在含5%脫脂奶粉-TBST中室溫封閉1 h，將PVDF膜分別同β-actin（1:1000）、OPG（1:1000）以及PTGS2（1:1000）等一抗置于4℃冰箱中孵育過夜。次日與熒光二抗（1:5000）室溫下孵育1 h，再次加入TBST洗膜3次，最后放入熒光蛋白質(zhì)免疫印跡成像系統(tǒng)中成像并測定灰度值。

1.2.3 樣本及芯片分析通過Trizol法提取總RNA進(jìn)行芯片雜交。使用Agilent Feature Extraction軟件（v11.0.1.1）獲得芯片圖，使用GeneSpring GX v12.1軟件（Agilent Technologies）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行Pathway和GO的富集分析，使用編寫腳本進(jìn)行層次聚類和關(guān)聯(lián)分析。樣本芯片分析由上海康成生物有限公司合作完成。

1.2.4 RNA的提取與測定采用RNA提取試劑盒從各組細(xì)胞中提取RNA，按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)一步提純，使用分光光度儀測得總RNA純度和濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBR green 染料方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在Rochee Light Cycler480熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR程序反應(yīng)、數(shù)據(jù)收集和分析。PCR反應(yīng)體系（20 μl）為：2×SYBR Green mix 10 μl，正向引物（10 μmol/L）1.4 μl，反向引物（10 μmol/L）1.4 μl，無酶水5.7 μl，cDNA 1.5 μl，無菌水7 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，使用β-actin RNA作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析。引物序列：β-actin，正義5'-CCTGGCACCCAGCACAAT -3'，反義5'-GCCGATCCACACGGAGTA -3'；PACERR，正義5'-ACTGATCGCCTTGGATGGGA -3'，反義5'- CGTGACTTCCTCGACCCTCT-3'；PTGS2，正義5'- TCTCCTGCCTACTGGAAGCC-3'，反義5'-CTAGTCCGGAGCGGGAAGAA -3'。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 HAVSMCs培養(yǎng)AGEs對(duì)HAVSMCs鈣化的作用取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下可見單個(gè)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HAVSMCs）呈梭形、三角形或多邊形，細(xì)胞生長到一定密度可見“波峰一波谷”狀的平滑肌細(xì)胞生長特征（圖1A、B、C）。與對(duì)照組相比，AGEs鈣化干預(yù)組的鈣化相關(guān)蛋白水平明顯增加，加入100 mg/L AGEs時(shí)鈣化相關(guān)蛋白表達(dá)最明顯（圖1D、E），表明100 mg/L是AGEs誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化的最佳濃度。

圖1 HASMCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)和不同濃度AGEs對(duì)HASMCs細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化的情況

2.2 LncRNA在鈣化HAVSMCs中的差異表達(dá)譜通過與對(duì)照組相比較，AGEs鈣化干預(yù)組經(jīng)芯片檢測分析（圖2），有661個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，293個(gè)lncRNA表達(dá)降低（P＜0.05），并且有741個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，235個(gè)mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。AGEs鈣化干預(yù)組的分析結(jié)果相比對(duì)照組，lncRNA存在明顯的差異表達(dá)，提示lncRNA很有可能參與人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化的生物學(xué)過程（圖3）。

圖2 芯片掃描圖

圖3 對(duì)照組與AGEs干預(yù)組細(xì)胞差異lncRNA基因表達(dá)譜

2.3 生物信息學(xué)分析使用top GO進(jìn)行差異mRNA的GO分析以推斷它們參與的分子功能。GO分析包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)部分，表達(dá)上調(diào)的mRNA中富集顯著前10的GO條目分別包括防御反應(yīng)、外部刺激反應(yīng)、受體配體活動(dòng)、受體調(diào)節(jié)因子活動(dòng)、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)等（圖4A、C、E），表達(dá)下調(diào)的mRNA中富集顯著前10的GO條目分別包括前列腺素受體活性、多細(xì)胞生物過程、結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、胞質(zhì)區(qū)、細(xì)胞皮層、結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、肌動(dòng)蛋白結(jié)合等（圖4B、D、F），說明血管細(xì)胞鈣化可能是細(xì)胞針對(duì)外界刺激，如高糖、糖基化產(chǎn)物、炎性因子等刺激做出異常應(yīng)答產(chǎn)生一系列的病理生理過程。同時(shí)，差異表達(dá)mRNA參與的包括TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、移植物抗宿主疾病、礦物質(zhì)吸收等前10通路上存在顯著富集（圖5），進(jìn)一步說明細(xì)胞鈣化過程涉及礦物質(zhì)沉積、鈣化相關(guān)信號(hào)通路激活的過程。

圖4 差異表達(dá)mRNA GO分析

圖5 差異表達(dá)mRNA KEGG通路分析

2.4 鈣化相關(guān)lncRNA預(yù)測及初步驗(yàn)證通過芯片分析篩選出的差異表達(dá)的lncRNA中，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)序列名為PACERR的lncRNA（圖6）在鈣化干預(yù)組中明顯上調(diào)，該轉(zhuǎn)錄本位于1號(hào)染色體，含825個(gè)堿基，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)其與前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）蛋白編碼基因位置關(guān)系密切，PTGS2是參與前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，正如我們之前預(yù)測的GO分析富集的前列腺素受體活性結(jié)果相一致，因此猜測PACERR可能通過調(diào)控PTGS2在平滑肌細(xì)胞鈣化中發(fā)揮作用。

通過qPCR法驗(yàn)證可見相對(duì)于對(duì)照組，AGEs鈣化干預(yù)組中PACERR表達(dá)絕對(duì)上調(diào)（圖7A），鄰近蛋白編碼基因PTGS2表達(dá)在轉(zhuǎn)錄（圖7B）和翻譯水平（圖7C、D）也同時(shí)上調(diào)，與芯片結(jié)果相符。隨著AGEs干預(yù)濃度上調(diào)和干預(yù)時(shí)間延長，PACERR表達(dá)量逐漸升高，在干預(yù)48 h時(shí)達(dá)高峰（圖7C），AGEs濃度在200 mg/L時(shí)表達(dá)豐度最明顯（圖7E）。沉默PACERR后其表達(dá)量降低（圖8A），位于其下游的PTGS2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯表達(dá)同時(shí)下降（圖8B、C、D），且鈣化相關(guān)蛋白OPG降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的預(yù)測。

圖7 RT-PCR和Western blot驗(yàn)證lncRNA PACERR和功能蛋白的差異表達(dá)

圖8 RT-PCR和Western blot驗(yàn)證lncRNA PACERR抑制和抑制lncRNA對(duì)功能蛋白的影響

3 討論

在既往研究中，lncRNA被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”或者是“轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物”，其本身不參與機(jī)體基因的調(diào)控過程，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高和前期大量研究的探索，lncRNA在生物轉(zhuǎn)錄本功能逐漸被挖掘出來，激起研究人員的廣泛興趣。盡管目前l(fā)ncRNA研究成果頗豐，甚至在臨床診療上已經(jīng)取得了重大實(shí)踐進(jìn)展，但大多數(shù)lncRNA的特征和功能仍尚不清楚。與其他非編碼RNA相比，lncRNA在空間和結(jié)構(gòu)上體現(xiàn)出了多重復(fù)雜性，使其在攜帶更多的生物學(xué)信息上具有更多優(yōu)勢。目前根據(jù)lncRNA在基因組上相對(duì)于蛋白編碼基因的定位及其來源，人們把lncRNA分為主要的6大類：正義lncRNA、反義lncRNA、內(nèi)含子間lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA和環(huán)狀RNA[15]。其在基因上的定位與功能相關(guān)，不同的lncRNA在胞核和胞質(zhì)內(nèi)參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)錄本剪接、蛋白定位、蛋白構(gòu)象及mRNA穩(wěn)定性等各種各樣的生物學(xué)功能。比如lncRNA GAS5在血管重塑過程中通過激活p53途徑對(duì)VSMC增殖，促進(jìn)細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生負(fù)面影響[16]。還有研究表明過表達(dá)的lncRNA MEG3可通過抑制TGF-β1和VEGF的表達(dá)而抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[17]。

本研究利用糖基化終末產(chǎn)物建立人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣化模型，通過芯片技術(shù)進(jìn)行正常平滑肌細(xì)胞和鈣化平滑肌細(xì)胞的lncRNA及其共表達(dá)mRNA表達(dá)譜分析，篩選出大量的差異表達(dá)的lncRNA數(shù)據(jù)，相比對(duì)照組，其中有661個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，293個(gè)lncRNA表達(dá)降低，并且有741個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，235個(gè)mRNA表達(dá)降低。通過GO分析和KEGG通路分析其共表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能，其中在上調(diào)的共表達(dá)mRNA中，TNF信號(hào)通路細(xì)胞因子富集度較高，在下調(diào)的共表達(dá)mRNA中，神經(jīng)活性配體受體相互作用、鈣信號(hào)通路富集度較高，而鈣信號(hào)通路參與調(diào)劑鈣離子與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[18]，這些結(jié)果再次提示lncRNA可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路、細(xì)胞因子在血管平滑肌細(xì)胞鈣化中發(fā)揮重要作用。我們通過預(yù)測lncRNA上下游鄰近的mRNA預(yù)測lncRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的作用靶點(diǎn)，其中篩選出上調(diào)的lncRNA PACERR，與細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)作用呈正相關(guān)，并在一定條件下表達(dá)量達(dá)到峰值，與其下游的功能蛋白PTGS2轉(zhuǎn)錄及翻譯呈正相關(guān)，而研究表明PTGS2在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上參與了成骨分化、腫瘤等多種病理過程[19,20]。我們研究結(jié)果顯示，長鏈非編碼RNA PACERR在鈣化人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞顯著上調(diào)，很可能通過PTG2靶基因的調(diào)控參與血管平滑肌細(xì)胞鈣化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。同時(shí)驗(yàn)證了PTGS2在鈣化平滑肌細(xì)胞中明顯上調(diào)，這與芯片結(jié)果一致。但lncRNA與共表達(dá)mRNA作用于細(xì)胞共同參與鈣化的具體機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步研究機(jī)制靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)并篩選出晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的特異表達(dá)的lncRNA譜及其共表達(dá)下游mRNA，這些差異表達(dá)的lncRNA及共表達(dá)靶基因可能在血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，其中l(wèi)ncRNA及其共表達(dá)下游mRNA關(guān)系得到驗(yàn)證，利用芯片進(jìn)行生信分析獲得的數(shù)據(jù)，為研究糖尿病血管鈣化的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路，可能在未來成為糖尿病血管疾病臨床診療的重要部分。