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        仿刺參成參體腔細(xì)胞酚氧化酶的生化與酶學(xué)特性研究

        2021-07-21 05:14:16蔣經(jīng)偉李石磊周遵春
        水產(chǎn)科學(xué) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:鄰苯二酚刺參體腔

        肖 瑤,蔣經(jīng)偉,李石磊,董 穎,周遵春

        ( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧 大連 116023 )

        酚氧化酶(PO)作為無(wú)脊椎動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的免疫組分之一,其自身通常不具有殺菌或抑菌活性,但可以催化酚類底物生成醌類,醌類再經(jīng)過(guò)一系列的非酶促反應(yīng)最終生成黑色素[1]。醌類物質(zhì)被報(bào)道具有殺菌和抑菌等作用,而黑色素也被發(fā)現(xiàn)具有凝集病原菌、修復(fù)損傷和介導(dǎo)吞噬等作用[2]。

        酚氧化酶免疫功能的發(fā)揮與其自身的生化和酶學(xué)特性密切相關(guān)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn),用純化后的酚氧化酶進(jìn)行的生化及酶學(xué)特性研究,對(duì)了解酚氧化酶的免疫特性具有重要意義,酚氧化酶的分離純化及生化特性研究在昆蟲和甲殼類動(dòng)物中已有廣泛報(bào)道[4],在無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi),除血淋巴外,其他組織在常態(tài)下酚氧化酶不表達(dá),而在應(yīng)激狀態(tài)下可迅速啟動(dòng)潛在的酚氧化酶表達(dá)和釋放能力,從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫和抵抗水平[5]。因此,了解酚氧化酶的生化和酶學(xué)特性對(duì)解析酚氧化酶的免疫功能具有重要意義。目前在悉尼巖牡蠣(Saccostreaglomerata)[2]、光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)[6]、阿根廷滑柔魚(Illexargentinus)[7]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[8]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中,相繼開(kāi)展了酚氧化酶的生化與酶學(xué)特性分析。在光棘球海膽和櫛孔扇貝中,各發(fā)現(xiàn)了3種酚氧化酶,在悉尼巖牡蠣中發(fā)現(xiàn)了2種酚氧化酶[2,6-9]。

        仿刺參(Apostichopusjaponicus)是棘皮動(dòng)物門的典型代表生物,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是我國(guó)海水增養(yǎng)殖的重要品種之一[5,10]。近年來(lái),隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,病害時(shí)有發(fā)生[11]。研究仿刺參的免疫和生理特性,對(duì)其病害防控具有重要意義。

        已有的研究發(fā)現(xiàn),仿刺參幼參體腔液中含有3種酚氧化酶[12],分別為AjPO1、AjPO2和AjPO3。這3種酚氧化酶的分子質(zhì)量均小于21 ku,具有不同的生理、生化特性,并且承擔(dān)不同的免疫功能。之后在仿刺參成參的體腔上清液和體腔細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與幼參相同的AjPO2和AjPO3,同時(shí)在成參體腔細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了3種新酚氧化酶,這3種酚氧化酶在仿刺參雌、雄個(gè)體間的分布存在差異,其中雌性個(gè)體的體腔細(xì)胞中3種酚氧化酶同時(shí)存在,而雄性個(gè)體的體腔細(xì)胞中僅有2種酚氧化酶存在[13]。目前仿刺參成參體腔細(xì)胞中酚氧化酶系統(tǒng)的具體生化特性和功能的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

        筆者自仿刺參成參體腔細(xì)胞中分離純化出4種酚氧化酶,對(duì)4種酚氧化酶的耐熱性、最適pH、底物特異性、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、二價(jià)金屬離子和抑制劑對(duì)酶活性的影響方面進(jìn)行研究,為進(jìn)一步查明仿刺參成參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能機(jī)制、探索酚氧化酶系統(tǒng)在仿刺參中的免疫和生理功能提供基礎(chǔ)支持。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

        體質(zhì)量(236±5) g仿刺參雌、雄各30頭,在仿刺參產(chǎn)卵時(shí),根據(jù)排精排卵來(lái)判斷雌雄,并將雌、雄仿刺參分別于試驗(yàn)室暫養(yǎng)(水溫15~18 ℃,pH 8.1~8.3,鹽度31)7 d。樣品均取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院海水養(yǎng)殖引育種中心。

        1.2 體腔細(xì)胞破碎液的制備

        用剪刀分別將雌、雄仿刺參從腹部劃開(kāi),收集仿刺參體腔液,分別進(jìn)行離心(4 ℃,6000 r/min,10 min),棄上清液,將雌、雄仿刺參的體腔細(xì)胞分別充分混勻后,加入磷酸緩沖液,經(jīng)超聲波破碎后再次進(jìn)行離心(4 ℃,14 000 r/min,25 min),取體腔細(xì)胞破碎上清液,凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 仿刺參酚氧化酶的分離純化

        采用鄰苯二酚發(fā)色法結(jié)合線性連續(xù)梯度非變性電泳的方法來(lái)分離雌、雄仿刺參體腔細(xì)胞破碎液中的酚氧化酶[11]。在含量為6%~18%的線性連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳17 h(4 ℃,恒功率2 W),使用分子質(zhì)量為480~1236 ku的非變性電泳Marker作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白參考;電泳結(jié)束后,參考文獻(xiàn)[6]分離光棘球海膽酚氧化酶的操作方法進(jìn)行雌、雄仿刺參酚氧化酶的分離純化。將純化后的雌、雄仿刺參的酚氧化酶溶液,凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        采用多巴絡(luò)合物生成法[14]測(cè)定酚氧化酶活性,在490 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光度值(D490),D490每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活性單位(U)。將時(shí)間和測(cè)得吸光度值的線性規(guī)律繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到公式(1),將不同條件下的吸光度值分別代入公式(1)即可得到不同條件下的酶活性。

        y=kx+b

        (1)

        式中,x為時(shí)間,y為吸光度值,斜率k的絕對(duì)值即酶活性,b為截距。

        1.4 pH和高溫對(duì)酶活性的影響

        用濃度15 mmol/L的左旋多巴溶于pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中,通過(guò)向1.5 mol/L的Tris溶液中滴加濃鹽酸的方法來(lái)調(diào)節(jié)緩沖液的pH,100 μL純化后的酚氧化酶溶液與2.0 mL不同pH的左旋多巴溶液混勻后,采用分光光度法在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

        將4種酚氧化酶分別在沸水中加熱5、10、20、30 min,以20 mmol/L多巴胺為底物與加熱后4種酚氧化酶混合,采用分光光度法在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

        開(kāi)孔鋼板連接件(perfobond strip connector,也稱為PBL連接件)是1987年,德國(guó)學(xué)者Leonhardt在解決委內(nèi)瑞拉的卡羅尼第三大橋組合結(jié)構(gòu)剪力連接件的疲勞問(wèn)題時(shí)提出的一種新型剪力連接件[2].PBL連接件是通過(guò)開(kāi)孔鋼板在混凝土板中形成的一系列混凝土榫、開(kāi)孔鋼板和貫穿鋼筋共同承擔(dān)剪力.

        1.5 二價(jià)金屬離子對(duì)酶活性的影響

        選用Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+、Cd2+、Fe2+、Zn2+進(jìn)行二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性影響的試驗(yàn),分別使用CaCl2、MgSO4、CuSO4、MnSO4、Pb(CH3COO)2、CdCl2、FeSO4、ZnSO4作為金屬離子的來(lái)源,采用超純水作為空白對(duì)照,參照文獻(xiàn)[6]的方法操作。得到的混合物用分光光度法在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

        1.6 抑制劑對(duì)酶活性的影響

        選取抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、二乙基二硫代氨基甲酸鈉作為酚氧化酶的抑制劑,超純水作為空白對(duì)照,并參照文獻(xiàn)[6]的試驗(yàn)方法操作。得到的混合物采用分光光度法,在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值, 分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組酚氧化酶活性。

        1.7 底物特異性

        選用鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚作為不同底物,對(duì)照組用等體積的Tris-HCl緩沖液(pH 7),參照文獻(xiàn)[6]的試驗(yàn)方法操作,得到的混合物用分光光度法在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算各組酚氧化酶活性。

        1.8 數(shù)據(jù)分析

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較,獲得不同抑制劑對(duì)酶活性作用的差異性,P<0.05視為顯著抑制,P<0.01視為極顯著抑制,用Origin 7.5軟件制圖。

        2 結(jié) 果

        2.1 仿刺參酚氧化酶的分離純化

        非變性電泳后,經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色,共發(fā)現(xiàn)4條酚氧化酶條帶,均呈現(xiàn)褐色(圖1a)。為區(qū)別于仿刺參幼參體內(nèi)的3種酚氧化酶,將這4種酚氧化酶按分子質(zhì)量由高到低分別命名為AjPO4、AjPO5、AjPO6、AjPO7,與右側(cè)(圖1b)Jiang等[13]的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,可知AjPO5為本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的新酚氧化酶,這4種酚氧化酶的分子質(zhì)量均大于Marker中標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量為720 ku的條帶,其中分子質(zhì)量越小的條帶遷移速率越快。

        圖1 雌雄仿刺參體腔細(xì)胞破碎液非變性電泳圖Fig.1 Native-PAGE of coelomocyte lysate supernatant (CLS) in male and female sea cucumber A. japonicusa:1.非變性電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 2~4.雄性仿刺參電泳條帶; 5~7.雌性仿刺參電泳條帶; b:1.雄性仿刺參電泳條帶; 2.雌性仿刺參電泳條帶[12].a:1.protein marker for native-PAGE; 2—4.CLS stained with catechol in male sea cucumber A.japonicus; 5—7.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus; b:1.CLS stained with catechol in sea cucumber male A. japonicus; 2.CLS stained with catechol in female sea cucumber A. japonicus[12].

        2.2 pH和溫度對(duì)酚氧化酶活性的影響

        測(cè)定的pH為2.0~10.0,使用多巴胺作為底物,仿刺參中AjPO4和AjPO6在pH為9.0時(shí)具有最高活性,AjPO5和AjPO7在pH為8.0時(shí)具有最高活性;當(dāng)pH高于9.0時(shí),4種酚氧化酶的活性隨pH的升高而降低(圖2)。

        仿刺參酚氧化酶的耐熱性試驗(yàn)顯示,AjPO4、AjPO5、AjPO6在沸水中的時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活性基本無(wú)太大的影響,耐熱性較好;AjPO7在沸水中的時(shí)長(zhǎng)超過(guò)20 min時(shí)酶活性急劇下降,耐熱能力較其他3種弱一些(圖3)。

        2.3 二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性的影響

        Mn2+和Fe2+對(duì)仿刺參4種酚氧化酶活性均有很強(qiáng)的激活作用,激活程度隨金屬離子濃度的增加而變化。當(dāng)Mn2+濃度超過(guò)25 mmol/L時(shí),AjPO4酶活性開(kāi)始降低,Ca2+濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí),AjPO4酶活性開(kāi)始降低并逐漸失活。在Mn2+和Fe2+的作用下,AjPO5酶活性隨著金屬離子濃度的增加而增加,Pb2+、Cu2+、Zn2+對(duì)AjPO5酶活性有小幅度的激活。除了Mn2+和Fe2+外,其他金屬離子對(duì)AjPO6刺激作用并不明顯。在Fe2+的作用下,AjPO7酶活性增強(qiáng)明顯,當(dāng)Fe2+濃度超過(guò)25 mmol/L時(shí),AjPO7的酶活性開(kāi)始下降,當(dāng)Cd2+濃度超過(guò)15 mmol/L時(shí),該酚氧化酶活性有小幅度增強(qiáng)(圖4)。

        圖2 pH對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.2 The effects of pH on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

        圖3 仿刺參酚氧化酶的耐熱性Fig.3 The effects of temperature on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

        2.4 抑制劑對(duì)酚氧化酶活性的影響

        在仿刺參中,亞硫酸鈉、抗壞血酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、檸檬酸對(duì)酚氧化酶均有一定的抑制作用,乙二胺四乙酸二鈉對(duì)AjPO6和AjPO7有輕微抑制作用,對(duì)AjPO4、AjPO5無(wú)抑制作用。其中AjPO4、AjPO6和AjPO7受檸檬酸抑制最顯著,AjPO7受二乙基二硫代氨基甲酸鈉抑制較明顯(圖5)。亞硫酸鈉對(duì)4種酚氧化酶活性均有一定的抑制作用。

        2.5 酚氧化酶的底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

        使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算得出(圖6),AjPO4對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為0.25、5.76、50.00、33.33 mmol/L;AjPO5對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為4.89、6.61、14.29、8.77 mmol/L;AjPO6對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.51、2.65、8.85、14.29 mmol/L;AjPO7對(duì)鄰苯二酚、左旋多巴、多巴胺、對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為1.63、3.95、13.51、83.33 mmol/L。4種酚氧化酶的最適底物均為鄰苯二酚。

        圖4 不同金屬離子對(duì)AjPO4、AjPO5、AjPO6和AjPO7的影響Fig.4 The effects of different metal ions on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus

        圖5 不同抑制劑對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響Fig.5 The effects of different inhibitors on the proteins with PO-like activities in sea cucumber A. japonicus*表示顯著抑制(P<0.05),**表示極顯著抑制(P<0.01).* represents significant inhibition(P<0.05); ** represents very significant inhibition(P<0.01).

        3 討 論

        3.1 仿刺參體酚氧化酶的分離純化

        已有的研究發(fā)現(xiàn),在仿刺參成參體腔細(xì)胞內(nèi)存在3種不同于仿刺參幼參的酚氧化酶,其中雌性3種,雄性2種[12-13]。筆者在已有基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了1種新的酚氧化酶,這種酚氧化酶為雌、雄仿刺參共有,分子質(zhì)量為1048~1236 ku,與仿刺參幼參體內(nèi)酚氧化酶不同。發(fā)現(xiàn)的這4種成參特有的酚氧化酶的分子質(zhì)量均在720~1236 ku,分別承擔(dān)不同的生化特性和免疫反應(yīng)特性。為確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性,經(jīng)過(guò)多次的反復(fù)驗(yàn)證,80%情況下均可得到此酚氧化酶,由于這4種酚氧化酶在常溫下極易失活,所以存在沒(méi)有成功分離純化的情況,且這4種酚氧化酶的含量較低,通過(guò)非變性電泳的方法分離可能會(huì)出現(xiàn)失敗情況。

        3.2 酚氧化酶的底物特異性

        這4種酚氧化酶的分子質(zhì)量在其他物種中已發(fā)現(xiàn)的酚氧化酶中屬于分子質(zhì)量較大的。自亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)血淋巴中分離純化出酚氧化酶,該酶在非變性電泳中顯示其分子質(zhì)量為158 ku[14];在大螯蝦(Panulirusargus)[15]中,采用非變性電泳的方法從血淋巴中分離得到了酚氧化酶,該酶在非變性電泳中顯示分子質(zhì)量為300 ku;在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中線性連續(xù)梯度非變性電泳中酚氧化酶的分子質(zhì)量一般大于100 ku[16-17]。但在光棘球海膽的酚氧化酶系統(tǒng)中,酚氧化酶的分子質(zhì)量是遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker的最小值[6],這說(shuō)明兩種生物即使在進(jìn)化上相似,但也存在著酚氧化酶分子質(zhì)量差異較大的現(xiàn)象。動(dòng)力學(xué)分析表明,4種酚氧化酶最適底物為鄰苯二酚,米氏常數(shù)Km值分別為0.25、4.89、1.51、1.63。以左旋多巴為底物,仿刺參4種酚氧化酶的最適pH分別為9.0、8.0、9.0、8.0,這意味著,仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強(qiáng)。此外,這4種酚氧化酶在pH為5.0~7.0時(shí)活力較低,表明pH偏低的酸性條件對(duì)仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的功能可能產(chǎn)生抑制。

        3.3 酚氧化酶的耐熱性

        通過(guò)分析仿刺參酚氧化酶耐熱性的試驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)AjPO4、AjPO5、AjPO6 3種酚氧化酶在沸水中的時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活性無(wú)明顯影響,可以看出仿刺參酚氧化酶具有很好的耐熱性,這與大多數(shù)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶特征相同;而AjPO7在沸水中超過(guò)20 min活性開(kāi)始急劇下降,AjPO7是雌性仿刺參特有的一種酚氧化酶,其他3種酚氧化酶是雌、雄仿刺參共有。關(guān)于AjPO7與其他3種酚氧化酶的耐熱性差異能否對(duì)雌、雄仿刺參的耐熱性產(chǎn)生影響,還需進(jìn)一步研究。

        3.4 二價(jià)金屬離子對(duì)酚氧化酶活性的影響

        近年,有關(guān)在某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物人工配合飼料中添加金屬離子的報(bào)道較多。李荷芳等[18]研究表明,在中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)飼料中添加Mn2+,雖對(duì)增長(zhǎng)、增質(zhì)量無(wú)明顯影響,但卻能激活肝胰臟中的羧肽酶A;在皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[19-20]人工飼料中添加Ca2+、Fe3+、Mg2+等也有促生長(zhǎng)作用。本試驗(yàn)中以多巴胺為底物,與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強(qiáng),表明這2種金屬離子有助于仿刺參酚氧化酶的催化和酚氧化酶反應(yīng)速率的提高,由此推測(cè),在仿刺參飼料中添加一定量的Fe2+和Mn2+可能有助于增強(qiáng)仿刺參自身免疫活力。當(dāng)Fe2+濃度高于25 mmol/L時(shí),其他3種酚氧化酶活性上升,而AjPO7的活性出現(xiàn)明顯的下降,相比與其他3種酚氧化酶,AjPO7受二價(jià)鐵離子的影響機(jī)制可能存在特殊性。除Fe2+和Mn2+外的二價(jià)金屬離子對(duì)仿刺參4種酚氧化酶活性的影響均不顯著,這與光棘球海膽酚氧化酶活性受二價(jià)金屬離子催化的結(jié)果相近[6],這意味著仿刺參酚氧化酶與光棘球海膽酚氧化酶受二價(jià)金屬離子影響的機(jī)制可能相似。

        3.5 抑制劑對(duì)酚氧化酶活性的影響

        二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌、雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用。其中,二乙基二硫代氨基甲酸鈉是特異性的銅離子螯合劑,表明本試驗(yàn)中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅[5],這與其他無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶特性相似。然而,檸檬酸對(duì)仿刺參酚氧化酶活性的影響與其他海洋脊椎動(dòng)物如海灣扇貝(Argopectehsirradians)[16]、菲律賓蛤仔[8]、蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)[21]顯著不同,檸檬酸對(duì)雌、雄仿刺參4種酚氧化酶的抑制作用很明顯,要強(qiáng)于大多數(shù)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物,這意味著酚氧化酶的催化機(jī)制在不同物種間并不相同,具體原因和規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

        3.6 AjPO7的特異性

        AjPO7作為雌性仿刺參特有的1種酚氧化酶,與其他3種酚氧化酶相比,在耐熱性以及受二價(jià)金屬離子影響方面均有其特殊性,AjPO7的這種生化特性可為仿刺參雌雄鑒別技術(shù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。仿刺參這4種酚氧化酶生化與酶學(xué)特性的研究,有助于進(jìn)一步了解仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)的特性和功能,并為刺參免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)。

        4 結(jié) 論

        本試驗(yàn)在仿刺參成參體腔細(xì)胞中分離純化出4種酚氧化酶,其中雄性3種,雌性4種,分子質(zhì)量為720~1236 ku,且具有很好的耐熱性,與大多數(shù)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶的特征相同。4種酚氧化酶均屬于漆酶型酚氧化酶,并對(duì)鄰苯二酚的親和力最高。4種酚氧化酶最適pH的研究表明,仿刺參酚氧化酶系統(tǒng)在弱堿性環(huán)境下活性更強(qiáng)。與Fe2+和Mn2+孵育后的4種酚氧化酶活性均有顯著增強(qiáng)。二乙基二硫代氨基甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和亞硫酸鈉均有較明顯的抑制雌雄仿刺參4種酚氧化酶活性的作用,表明本試驗(yàn)中的雌、雄仿刺參4種酚氧化酶含銅,與其他無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶特性相似。

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