杜新瑩，王洪梅，何洪彬

(1. 山東師范大學 生命科學學院，山東 濟南 250014；2. 山東師范大學 反芻動物疾病研究中心， 山東 濟南 250014)

Wnt通路是調控細胞增殖分化、胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)及細胞癌變等生物過程的高度保守的信號通路[1-3]，主要分為依賴β-連環(huán)蛋白(β-catenin,β-CAT)的經典Wnt通路、平面細胞極性非經典Wnt通路以及Wnt-Ca+非經典Wnt通路[4]。在經典Wnt通路中，腺瘤樣蛋白( colorectal adenoma-like protein，APC)、軸相關蛋白( axin-related protein，Axin)、周期蛋白依賴性激酶抑制因子1(casein kinase 1,CK1)和G-聯(lián)蛋白糖原合成酶激酶3β( glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)組成的降解復合體對于該信號通路的調控發(fā)揮關鍵作用[5]。當Wnt通路未激活時，β-連環(huán)蛋白降解復合體處于穩(wěn)定狀態(tài)，CK1和GSK-3β先后磷酸化β-連環(huán)蛋白特定位點，磷酸化的β-連環(huán)蛋白被泛素連接酶識別，隨后通過蛋白酶體降解。因此，細胞質內β-連環(huán)蛋白的蛋白濃度維持在較低水平。當Wnt通路激活時，β-連環(huán)蛋白降解復合體解聚，細胞質內的β-連環(huán)蛋白不斷積累，并進入細胞核與TCF/LEF結合，啟動c-myc、cyclin等下游基因的轉錄表達[2，6-8]。

據報道，β-連環(huán)蛋白影響人類免疫缺陷病毒、類豬圓環(huán)病毒、人類巨細胞病毒、丙型肝炎病毒等多種病毒的增殖和復制[9-11]，而β-連環(huán)蛋白對牛病毒復制影響的研究較少。因此，本試驗通過構建牛β-連環(huán)蛋白RNA干擾載體，篩選出有效沉默牛β-連環(huán)蛋白的shRNA載體，并建立沉默牛β-連環(huán)蛋白的MDBK細胞系，為從基因沉默水平開展β-連環(huán)蛋白功能研究及其對牛病毒復制影響的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和載體

293T細胞、MDBK細胞、大腸桿菌DH5α均由本實驗室保存；β-連環(huán)蛋白過表達重組載體pLVX-IRES-Flag-β-catenin由本實驗室構建和保存；慢病毒包裝載體pYr-Lvsh及輔助質粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG購買自長沙贏潤生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PBS、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM均為Gibco公司產品，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒均購買自北京天根生化科技有限公司，轉染試劑Attractene○R為QIAGEN公司產品，細胞裂解液RIPA、5× SDS蛋白上樣緩沖液、TBE電泳緩沖液、轉膜液、10%PAGE凝膠試劑盒、TBST、超靈敏化學發(fā)光檢測試劑盒均購買自上海雅酶生物科技有限公司，β-連環(huán)蛋白抗體、Flag抗體來自Santa Cruz公司。

1.3 引物設計

根據GenBank中牛β-連環(huán)蛋白的基因序列(NM_001076141)，利用網站(https://rnaidesigner. thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)設計3對針對牛β-連環(huán)蛋白基因的shRNA序列，另外設計1對陰性對照shRNA引物，其與牛基因組所有基因無同源性(見表1)。上述引物均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

表1 β-連環(huán)蛋白shRNA引物、陰性對照shRNA引物、測序引物序列Table 1 β-catenin shRNA primer, negative control shRNA primer , and sequencing primer

1.4 β-連環(huán)蛋白shRNA重組質粒的構建

將β-連環(huán)蛋白3對shRNA的上下游引物分別退火，根據慢病毒包裝系統(tǒng)說明書，退火體系如表2所示，退火方式為95 ℃水浴4 min，然后90 min內自然冷卻到室溫。隨后與經BamHI和EcoRI雙酶切的pYr-Lvsh載體連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布氨芐抗性的LB平板，37 ℃ 培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于含有氨芐的LB試管內，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜，使用質粒提取試劑盒提取質粒，進行XhoI單酶切鑒定和U6引物測序鑒定[12-14]。

1.5 β-連環(huán)蛋白shRNA重組質粒干擾效率驗證

將人腎上皮細胞(293T細胞)經10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，當細胞融合度達到70%～80%時進行轉染，Opti-MEM分別稀釋質粒和轉染試劑Attractene○R，分別將pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC與pLVX-IRES-β-catenin-Flag共轉染293T細胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)至48 h收獲細胞樣品進行Western blot。

表2 β-連環(huán)蛋白shRNA引物退火的體系Table 2 The system of annealing with primers ofβ-catenin shRNA

1.6 Western blot檢測

將60 mm培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)液棄掉，加入PBS清洗2遍，刮取細胞后4 ℃、3 000 r/min離心4 min，棄上清；在細胞沉淀內加入適量細胞裂解液RIPA在冰浴條件下裂解1 h，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，取細胞裂解上清液；在細胞裂解上清液內按比例加入5× SDS蛋白上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min；取20 μL煮沸的蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳，將膠分離并轉移至PVDF膜；將PVDF膜置于孵育盒內，加入8%脫脂奶粉室溫封閉2 h；棄去封閉液，加入含Flag一抗的新鮮封閉液，室溫孵育2 h；棄掉一抗，用TBST洗膜3遍，5 min/遍；加入含二抗的新鮮封閉液，室溫孵育2 h；棄掉二抗，用TBST洗膜3遍，5 min/遍；PVDF膜上滴加適量ECL顯色液，利用化學發(fā)光儀成像。

1.7 慢病毒的包裝

293T細胞培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿內，當細胞融合度為70%～80% 時，將輔助質粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG分別與pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC共轉染293T細胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，無菌收集上清液，4 ℃、3000 r/min 離心 10 min，收集上清液，其內含有包裝好的重組慢病毒。

1.8 沉默β-連環(huán)蛋白的MDBK單克隆細胞的篩選與鑒定

將培養(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿內、細胞融合度為70%～80%的MDBK細胞加入包裝好的重組慢病毒和適量新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；慢病毒感染48 h后，更換含有5 μg/mL嘌呤霉素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換液一次，直至長出單細胞克隆。通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞克隆，培養(yǎng)后利用克隆環(huán)分離帶有綠色熒光的單克隆，傳代擴大培養(yǎng)[15]，并通過Western blot檢測β-連環(huán)蛋白的沉默效果。

2 結果與分析

2.1 成功構建pYr-Lvsh-β-CAT載體

分別將3種shRNA上、下游引物進行退火，得到干擾牛β-連環(huán)蛋白基因的shRNA。慢病毒載體pYr-Lvsh經BamHI和EcoRI雙酶切后與β-連環(huán)蛋白的shRNA分別進行連接、轉化，提取質粒DNA，使用XhoI單酶切鑒定。由于pYr-Lvsh載體和shRNA內均含有1個XhoI酶切位點，XhoI單酶切后產生2條約為6.5 kb和2 kb的條帶(圖1)。將酶切鑒定正確的重組質粒進行測序鑒定，將測序正確的陽性重組質粒分別命名為pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3，對照質粒命名為pYr-Lvsh-NC。

2.2 沉默β-連環(huán)蛋白的干擾重組載體的篩選

將β-連環(huán)蛋白過表達重組質粒pLVX-IRES-β-catenin-Flag分別與pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3、pYr-Lvsh-NC共轉染到293T細胞，利用Flag抗體，通過Western blot檢測β-連環(huán)蛋白的表達情況，以篩選有效沉默β-連環(huán)蛋白的干擾載體。如圖2所示，與對照pYr-Lvsh-NC相比，pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3均未檢測到β-連環(huán)蛋白的表達，表明重組干擾載體pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3有效地沉默了β-連環(huán)蛋白的表達。

圖1 β-CAT shRNA重組載體Xho I單酶切鑒定結果Fig.1 Single-enzyme digestion identification of the β-CATshRNA recombinant vector by Xho I 1. pYr-Lvsh-NC;2. pYr-Lvsh-β-CAT1;3. pYr-Lvsh-β-CAT2;4. pYr-Lvsh-β-CAT3;M.DL10000DNA Marker

圖2 β-CAT shRNA重組載體干擾效率的驗證Fig.2 Identification about interference efficiency of β-CAT shRNA recombinant vector 1. pYr-Lvsh-β-CAT1;2. pYr-Lvsh-β-CAT2;3. pYr-Lvsh-β-CAT3;4. pYr-Lvsh-NC

2.3 重組慢病毒的包裝

將重組慢病毒載體pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3和pYr-Lvsh-NC 分別與輔助質粒在293T細胞上進行慢病毒包裝。在所構建的重組pYr-Lvsh-β-CAT1/2/3載體中，shRNA位于hU6 啟動子下游，載體中還有CMV啟動子的copGFP元件。重組載體轉染細胞后，GFP表達。因此，通過倒置熒光顯微鏡檢測帶有GFP熒光的細胞，結果如圖3所示，表達GFP的細胞在90%以上，表明獲得的4種重組載體均成功包裝出高效的重組慢病毒。

2.4 沉默β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定細胞系的篩選

將包裝好的重組慢病毒感染MDBK細胞，經嘌呤霉素抗性篩選出6株細胞克隆，其中pYr-Lvsh-β-CAT1的細胞克隆2株，分別命名為shβ-CAT1-1、shβ-CAT1-2；pYr-Lvsh-β-CAT2的細胞克隆2株，分別命名為shβ-CAT2-1、shβ-CAT2-2；pYr-Lvsh-β-CAT3和pYr-Lvsh-NC的細胞克隆各1株，分別命名為shβ-CAT3-1和sh NC。Western blot檢測上述6株細胞克隆β-連環(huán)蛋白的表達，使用ImageJ軟件進行灰度分析，通過β-CAT/β-actin進行定量分析，結果如圖4所示。與對照細胞系shNC相比，shβ-CAT1-2和shβ-CAT2-2細胞系中β-連環(huán)蛋白的表達顯著降低，由此表明這2株細胞系可有效沉默β-連環(huán)蛋白。

圖3 重組慢病毒感染293T細胞的熒光檢測Fig.3 Fluorescence detection of 293T cells infected by recombinant lentivirus 1. pYr-Lvsh-β-CAT1;2. pYr-Lvsh-β-CAT2;3. pYr-Lvsh-β-CAT3;4. pYr-Lvsh-NC

圖4 β-CAT干擾細胞系的篩選與鑒定Fig.4 Screening and identification of the cell linesstably silencing with β-CAT1. sh β-CAT1-1;2. sh β-CAT1-2;3. sh β-CAT2-1;4. sh β-CAT2-2;5. sh β-CAT3-1 6. sh NC

3 討 論

近些年中國養(yǎng)牛業(yè)快速發(fā)展，集約化程度不斷提高，與此同時牛病毒性傳染病的預防和控制形勢日益嚴峻。目前可用于牛病毒性疾病的商品化疫苗較少，因而有必要進行包括天然免疫在內的多種途徑的綜合防控研究，以期找到新的藥物靶點，為抗病毒新藥的研發(fā)提供思路和線索。β-連環(huán)蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的一個關鍵組分，在抗病毒免疫反應中發(fā)揮重要作用，可以直接或間接地調控HIV、HCMV、HCV等多種病毒的增殖復制和致病性。一方面，激活Wnt/β-catenin 信號通路可以促進某些病毒的增殖。研究表明，激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進牛皰疹病毒1型的增殖復制；使用Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進流感病毒mRNA的表達以及流感病毒病毒粒子的產生。另一方面，激活Wnt/β-catenin 信號通路可以抑制某些病毒的增殖，使用LiCl激活Wnt/β-catenin通路可以抑制HIV在外周單核細胞中的增殖；敲除β-連環(huán)蛋白基因可以有效促進艾滋病病毒的增殖[16-18]。然而，β-連環(huán)蛋白對牛易感病毒影響的研究相對較少，尤其是β-連環(huán)蛋白是否參與牛副流感病毒的復制目前還缺乏深入的研究。

過表達和沉默是研究基因功能的主要技術手段，β-連環(huán)蛋白在昆蟲細胞、哺乳動物細胞及人多種細胞內穩(wěn)定表達。通過沉默β-連環(huán)蛋白可以為研究β-連環(huán)蛋白與其他基因相互作用以及對病毒復制的影響提供一個重要途徑。本研究針對牛β-連環(huán)蛋白序列設計shRNA特異性引物并構建重組載體，隨后包裝出的重組慢病毒感染細胞，shRNA被表達出來，在細胞質中被Dicer酶降解為siRNA，發(fā)揮RNA干擾活性。由于MDBK細胞難以轉染，因而，在本研究中利用慢病毒包裝及嘌呤霉素抗性篩選來構建MDBK穩(wěn)定細胞系。所篩選到的shβ-CAT1-2和shβ-CAT2-2細胞系能夠有效沉默β-連環(huán)蛋白的表達，經過多次傳代仍能保持較好的沉默效果，最終篩選出高效沉默干擾β-連環(huán)蛋白的細胞系，解決了瞬時轉染效率低、試驗重復性差等問題。此外，MDBK細胞對牛的多種病毒易感，牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛流行熱病毒、牛副流感病毒3型等多種病毒均可在MDBK細胞定植、增殖，是研究牛病毒與宿主相互作用的重要細胞模型。

綜上所述，本研究中β-連環(huán)蛋白沉默細胞系的建立為研究其在Wnt信號通路中的作用及其對牛病毒增殖復制的影響提供了良好的細胞模型，并為深入研究β-連環(huán)蛋白的功能和機制奠定基礎。

4 結 論

本研究通過構建牛β-連環(huán)蛋白特異性shRNA慢病毒載體，進一步建立了穩(wěn)定干擾牛β-連環(huán)蛋白的MDBK細胞系，為牛β-連環(huán)蛋白與牛易感病毒的相互作用以及分子機制的進一步研究奠定基礎。