周德剛,楊紅玉, 項(xiàng)朝榮,馬超鋒

(1.洛陽惠中獸藥有限公司，河南 洛陽471000；2.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000；3.濟(jì)源市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 濟(jì)源 454650；4.信陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000)

腹瀉是豬養(yǎng)殖中較常見的疾病，不同階段豬群均可發(fā)病，可引起豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、血便、發(fā)燒、精神沉郁、厭食等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)造成豬只特別是幼齡仔豬的死亡，給豬場(chǎng)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。豬發(fā)生腹瀉的因素較多，有病原體的感染造成，如病毒(豬偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬藍(lán)耳病毒、豬輪狀病毒等)、細(xì)菌(葡萄球菌、致病性大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、巴氏桿菌、沙門菌、痢疾桿菌等)、寄生蟲(隱孢子蟲、附紅細(xì)胞體、弓形體、螺旋體等)，也有飼料發(fā)生霉變引起霉菌毒素中毒等因素引起的腹瀉[1-4]。從2011年開始，每到冬春季節(jié)，國(guó)內(nèi)部分豬場(chǎng)開始出現(xiàn)腹瀉情況，特別是哺乳仔豬的發(fā)病率和死亡率較高，至今還未得到有效控制，給養(yǎng)殖場(chǎng)戶帶來較大損失。為了解河南省豬場(chǎng)病毒性腹瀉流行狀況，組織人員在河南部分地區(qū)采集樣品進(jìn)行豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)、豬輪狀病毒感染(Porcine rotavirus infection，PoRV)的檢測(cè)，分析引起豬腹瀉的主要原因，以期為該病的防治提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2017年1月-2019年2月，在河南信陽、洛陽、濟(jì)源、周口、焦作、安陽、濮陽、駐馬店、新鄉(xiāng)和平頂山等地，選擇發(fā)生腹瀉的豬場(chǎng)，無菌取病死豬肛門拭子、腸內(nèi)容物、新鮮糞便等樣品，共采集1 052份樣品，低溫加冰包裝后，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室冷藏保存(0～4 ℃)備檢。

1.1.2 檢測(cè)試劑及儀器 檢測(cè)試劑：豬傳染性胃腸炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)、豬流行性腹瀉病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)、豬輪狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)，購(gòu)自廣州維伯鑫生物科技股份有限公司；核酸提取試劑盒，購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

儀器設(shè)備：生物安全柜(AC2-S1)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；全自動(dòng)核酸提取儀(NP968-C)，西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(TL988)，西安天隆科技有限公司；高速微量離心機(jī)(mikro185)，德國(guó)hettich公司；移液器(5～1 000 μL)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的PCR檢測(cè)及結(jié)果判定 所采集的樣品RNA的提取及PEDV、TGEV、PoRV 3種病毒核酸的檢測(cè)，操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性質(zhì)控品Ct>38或無Ct顯示，陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期且Ct≤32，以上條件同時(shí)滿足則試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)視為無效。

樣品檢測(cè)通道Ct≤35，且有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線判為陽性；檢測(cè)通道3538或無Ct值為陰性。

1.2.2 檢測(cè)數(shù)據(jù)處理 檢測(cè)結(jié)果采用R3.6.0軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析差異顯著性，P<0.05時(shí)表示差異顯著，P<0.01時(shí)表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬腹瀉類病毒總體檢測(cè)情況

本次3種腹瀉類病毒調(diào)查共檢測(cè)豬場(chǎng)51個(gè)，樣品1 052份，具體檢測(cè)情況如下：

傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)情況，陽性豬場(chǎng)21個(gè)、場(chǎng)陽性率為41.2%，其中最高的為焦作、場(chǎng)陽性率為60%，最低的是平頂山和濮陽、場(chǎng)陽性率均為25%；陽性樣品115份、陽性率10.9%，樣品陽性率最高為濮陽、陽性率為15.1%，最低的焦作為7.5%(見表1、圖1)。對(duì)不同地區(qū)場(chǎng)陽性率及樣品陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同地區(qū)之間差異不顯著(P>0.05)。

表1 豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of detection of TGEV

豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)情況，陽性豬場(chǎng)26個(gè)、場(chǎng)陽性率為51%，其中信陽地區(qū)場(chǎng)陽性率最高、達(dá)到75%，最低的新鄉(xiāng)、場(chǎng)陽性率25%；陽性樣品162份、陽性率15.4%，樣品陽性率最高為信陽、為18.4%，最低的為周口、為12.1%(見表2、圖2)。對(duì)不同地區(qū)場(chǎng)陽性率及樣品陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同地區(qū)之間差異不顯著(P>0.05)。

豬輪狀病毒檢測(cè)情況，陽性豬場(chǎng)15個(gè)、場(chǎng)陽性率為29.4%，其中洛陽、濟(jì)源2個(gè)地區(qū)陽性場(chǎng)率最高達(dá)到40%，最低的新鄉(xiāng)、平頂山2個(gè)地區(qū)未檢出陽性；陽性樣品30份、陽性率2.9%，樣品陽性率最高為洛陽、為4.7%，最低的新鄉(xiāng)和平頂山均為0(見表3、圖3)。對(duì)不同地區(qū)場(chǎng)陽性率及樣品陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同地區(qū)之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同月份腹瀉類病毒感染情況調(diào)查

從表4可以看出，全年均有豬傳染性胃腸炎病毒陽性檢出，總體陽性率為10.9%；11月、12月、1月、2月陽性率較高，均超過11%，達(dá)到11.5%、15.8%、14.6%和13.6，6月至9月陽性率較低，分別為6.7%、9.9%、8.1%和7.7%。對(duì)不同月份陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同月份之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 部分樣品TGEV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況1．陽性對(duì)照；2～3．陽性樣品；4～11．陰性樣品；12．陰性對(duì)照。下同F(xiàn)ig. 1 Real time PCR detection of TGEV in some samples 1．Positive control；2～3．positive sample；4～11．negative sample；12．negative control.The same below

從表5可以看出，全年豬流行性腹瀉病毒總體陽性率為15.4%；11月至次年4月陽性率較高，均超過16%，達(dá)到17.7%、18.8%、17.7%、19.4%、19.8%和17.7%；7月至9月陽性率較低，分別為9.9%、8.1%、9.2%。對(duì)不同月份陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同月份之間差異不顯著(P>0.05)。

從表6可以看出，全年有9個(gè)月有豬輪狀病毒陽性檢出，總體陽性率為2.9%；10月至次年2月陽性率較高，均超過4%，達(dá)到4.3%、5.3%、5%、4.2%和4.9%；6月至8月陽性率最低，未檢出陽性樣品。對(duì)不同月份陽性率統(tǒng)計(jì)分析表明，不同月份之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同腹瀉類病毒混合感染情況調(diào)查

從表7可見，本次調(diào)查的豬群腹瀉中有混合感染情況，其中，TGEV/PEDV兩重感染有53份，陽性率5%；TGEV/Po RV兩重感染有10份，陽性率0.95%；TGEV/ PEDV /PoRV三重感染有8份，陽性率0.76%。

表2 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of detection of PEDV

圖2 部分樣品PEDV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況Fig. 2 Real time PCR detection of PEDV in some samples

3 討 論

近年來，豬場(chǎng)腹瀉發(fā)生較多且因素較多，細(xì)菌性及寄生蟲性腹瀉可以通過藥敏試驗(yàn)等來選擇敏感藥物治療，霉菌性腹瀉可以調(diào)整飼料來解決，病毒性腹瀉較難防治且致死率較高，因此防控病毒性腹瀉的發(fā)生是豬場(chǎng)工作的重中之重。國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)腹瀉的發(fā)生大體可分為3個(gè)階段:第一階段為2010年及之前，國(guó)內(nèi)部分豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉，多在冬春季節(jié)發(fā)生且以中大豬為主，通過疫苗注射及對(duì)癥治療，大多能控制病情，且死亡不多；第二階段為2011-2016年，國(guó)內(nèi)大部分豬場(chǎng)發(fā)生腹瀉，不同階段豬群均可發(fā)生且有較多死亡，沒有有效的疫苗及藥物防治，給豬場(chǎng)帶來較大損失；第三階段為2016年至今，疫苗廠家根據(jù)國(guó)內(nèi)腹瀉發(fā)生及病原毒株變異情況，研制針對(duì)性較強(qiáng)的疫苗，基本控制了國(guó)內(nèi)自2011年以來的腹瀉大流行狀況。本次腹瀉調(diào)查覆蓋全省10個(gè)地區(qū)51個(gè)豬場(chǎng)，采集樣品1 052份，能夠部分代表當(dāng)前河南省豬場(chǎng)病毒性腹瀉發(fā)生的現(xiàn)狀。從總體檢測(cè)情況來看，本次調(diào)查河南地區(qū)豬群中3種病毒均有檢出，豬流行性腹瀉病毒的陽性率最高，場(chǎng)陽性率為51%、樣品陽性率為15.4%；豬傳染性胃腸炎病毒陽性率次之，場(chǎng)陽性率為41.2%、樣品陽性率為10.9%；豬輪狀病毒的陽性率最低，場(chǎng)陽性率為29.4%、樣品陽性率為2.9%，引起豬腹瀉的病毒在一定范圍內(nèi)的豬群存在。王瑞等[5]2015年調(diào)查河南信陽地區(qū)仔豬PEDV陽性率為61.82%,遠(yuǎn)高于本次調(diào)查，TGEV陽性率10.91%,與本次調(diào)查接近；崔新格[6]2018年調(diào)查河南腹瀉類病毒PEDV、TGEV、PoRV3種病毒陽性率分別為45.1%、26.67%和18.43%，均高于本次調(diào)查。PEDV陽性率方面，與國(guó)內(nèi)其他省市相比，貴州地區(qū)陽性率為72.72%[7]、廣東地區(qū)66.7%[8]、廣西地區(qū)54.94%[9]、江蘇地區(qū)36.3%[10]、遼寧地區(qū)36%[11]，遠(yuǎn)高于本次調(diào)查河南的15.4%；北京地區(qū)為4.66%[12]，低于本次調(diào)查。TGEV陽性率方面，北京2.58%、貴州1.52%、江蘇0.5%，廣東、廣西、遼寧3省均為0，均低于河南的陽性率。PoRV陽性率方面，遼寧41.3%、廣東23.4%、貴州12.12%、北京6.16%、廣西4.4%，均高于河南，江蘇1%低于河南省。本次調(diào)查了2017-2019年河南省3種病毒性腹瀉感染情況，整體陽性率較國(guó)內(nèi)其他地區(qū)低，是因調(diào)查是在新型腹瀉疫苗已在國(guó)內(nèi)大部分豬場(chǎng)應(yīng)用之后，病毒性腹瀉發(fā)生率已經(jīng)大大降低。

表3 豬輪狀病毒(PoRV)檢測(cè)情況統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistics of detection of PoRV

圖3 部分樣品PoRV實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況Fig. 3 Real time PCR detection of PoRV in some samples

表4 不同月份豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)情況Table 4 Detection of TGEV in different months

表5 不同月份豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)情況Table 5 Detection of PEDV in different months

表6 不同月份豬輪狀病毒檢測(cè)情況Table 6 Detection of PoRV in different months

表7 TGEV、PEDV和PoRV混合感染情況統(tǒng)計(jì)Table 7 Statistics of mixed infection of TGEV, PEDV and PORV

從不同季節(jié)來看，TGEV、PEDV全年均有檢出，PoRV夏季(6月、7月、8月)陽性率為0。整體來看，冬春季節(jié)病毒類腹瀉發(fā)生率較高，夏秋季節(jié)陽性率較低或不發(fā)生，與杜鵑等[12]調(diào)查的北京地區(qū)豬病毒性腹瀉夏季高發(fā)不同。分析有如下原因：一是冬春季節(jié)氣溫多變，晝夜溫差很大，雨雪霜凍天氣較多，甚至還會(huì)出現(xiàn)極端天氣，對(duì)豬群特別是仔豬是一個(gè)較大的應(yīng)激因素；二是為保證豬舍溫度，大多豬場(chǎng)采取保溫措施，因此豬舍通風(fēng)較差，給豬的生長(zhǎng)帶來不利影響，特別是潮濕、陰冷的水泥地面，不僅大大增加豬群腹瀉的發(fā)病率，而且會(huì)降低豬的飼料報(bào)酬，尤其是仔豬，氣候變化會(huì)引成腹瀉及多種疾病的發(fā)生。

本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)豬群病毒混合感染率6.7%，其中TGEV/PEDV兩重感染陽性率5%，TGEV/Po RV兩重感染有陽性率0.95%，TGEV/ PEDV /PoRV三重陽性率0.76%，結(jié)合實(shí)地調(diào)查，發(fā)生腹瀉的豬群還有細(xì)菌性和寄生蟲等其他因素，說明豬群發(fā)生腹瀉往往不是一種因素造成，在防治過程中還要綜合考慮。

4 結(jié) 論

本次采用熒光PCR方法對(duì)河南地區(qū)豬群的病毒性腹瀉感染情況進(jìn)行了調(diào)查，摸清了豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒感染3種疾病在河南省的不同地區(qū)、不同季節(jié)的分布及混合感染情況。在陽性率方面，豬流行性腹瀉病毒最高、豬傳染性胃腸炎病毒次之、豬輪狀病毒最低；這些病毒性疾病多在冬春季節(jié)發(fā)生，且有兩重或三重混合感染的發(fā)生。