郭 玲，路 萌

(衡水市人民醫(yī)院病理科，河北 衡水 053000)

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位。放射治療是目前乳腺癌患者的主要輔助治療手段，可有效降低乳腺癌的復(fù)發(fā)率，提高乳腺癌患者的生存率[1]，但是放射抵抗的出現(xiàn)使乳腺癌放療效果面臨挑戰(zhàn)[2]。因此，闡明乳腺癌放療抵抗的潛在機(jī)制對(duì)提高其放療效果具有重要意義。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類在哺乳動(dòng)物中大量表達(dá)、具有共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA分子，其通過與微小RNA(miRNA)或RNA結(jié)合蛋白結(jié)合參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，與化療耐藥、放療抵抗等均有關(guān)[3-5]。環(huán)狀RNA 0001982(circ_0001982)是一種乳腺癌致癌基因。敲低circ_0001982通過負(fù)調(diào)控miR-143抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡，成為乳腺癌防治的潛在靶點(diǎn)[6]。Interactome軟件靶基因預(yù)測(cè)顯示，miR-600可能與circ_0001982存在相互作用。既往研究[7]顯示，miR-600過表達(dá)可降低乳腺癌干細(xì)胞的自我更新能力并減弱其致瘤性，與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)。但circ_0001982是否靶向miR-600參與乳腺癌細(xì)胞放射抵抗尚不清楚。本研究旨在探討circ_0001982在乳腺癌細(xì)胞放射抵抗中的功能及circ_0001982是否靶向miR-600發(fā)揮作用，以期為靶向乳腺癌的放療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和組織標(biāo)本

人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；選取2016年1月至2018年1月于衡水市人民醫(yī)院確診為乳腺癌并接受手術(shù)治療的30例乳腺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。手術(shù)切除后，組織標(biāo)本立即在液氮中冷凍，并置于-80 ℃冰箱保存?；颊吣挲g38～65歲，中位年齡48歲，均為初診患者，手術(shù)前未接受任何化療或放射治療。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均知情同意。

1.1.2 主要試劑

小干擾RNA(si-RNA)及其對(duì)照(si-con)、miRNA模擬物(mimics)以及對(duì)照(miR-con)、miRNA抑制物(anti-miR)以及對(duì)照(anti-miR-con)、過表達(dá)載體(pcDNA-RNA)及其對(duì)照(pcDNA)、雙熒光素酶報(bào)告載體(WT-circ_0001982、MUT-circ_0001982)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于廣州銳博生物公司；通用SYBR-Green Master試劑盒購(gòu)于美國(guó)Roche公司；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)于福州飛凈生物科技公司；鼠源細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)、p21、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗鼠IgG二抗購(gòu)于美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。MCF-10A細(xì)胞采用含2 mM谷氨酰胺、100 ng·mL-1表皮生長(zhǎng)因子、0.1 mg·mL-1霍亂毒素、10 μg·mL-1胰島素、500 ng·mL-1氫化可的松、5%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)

按照TRIzol試劑使用說明提取乳腺癌組織、癌旁組織、MCF-7細(xì)胞、MCF-10A細(xì)胞中總RNA。使用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA qPCR試劑盒檢測(cè)miR-600表達(dá)。使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、通用SYBR-Green Master試劑盒檢測(cè)circ_0001982表達(dá)。以2-ΔΔCt方法計(jì)算circ_0001982和miR-600相對(duì)表達(dá)量。circ_0001982上游引物5′-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3′，下游引物5-CACAAATTCCCATC ATTCCC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游引物5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-600上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGA CUUACAGACAAGAGCC-3′，下游引物5′-CTC AACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA GTTGAGGAGCAAGG-3′；U6上游引物5′-AGCC CGCACTCAGAACATC-3′，下游引物5′-GCCACCAAGACAATCATCC-3′。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞接種六孔板，當(dāng)細(xì)胞50%匯合時(shí)根據(jù)Lipofectamine 2000使用說明進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染序列或載體不同分為si-con組、si-circ_0001982組、pcDNA組、pcDNA-circ_0001982組、circ_0001982+anti-miR-con組、si-circ_0001982+anti-miR-600組。用4 Gy劑量射線分別照射轉(zhuǎn)染si-con、si-circ_0001982、pcDNA、pcDNA-circ_0001982、si-circ_0001982+anti-miR-con、si-circ_0001982+anti-miR-600的MCF-7細(xì)胞，依次記為4 Gy+si-con組、4 Gy+si-circ_0001982組、4 Gy+pcDNA組、4 Gy+pcDNA-circ_0001982組、4 Gy+si-circ_0001982+anti-miR-con組、4 Gy+si-circ_0001982+anti-miR-600組。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染si-con、si-circ_0001982、miR-con、miR-600 mimics、si-circ_0001982+anti-miR-con、si-circ_0001982+anti-miR-600的MCF-7細(xì)胞接種到六孔板(500 個(gè)·孔-1)，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行不同劑量(0、2、4、6或8 Gy)的照射(源靶距為100 cm，劑量率2.4 Gy·min-1)。照射后培養(yǎng)10～14 d，用95%甲醇固定細(xì)胞克隆，1%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。采用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算模型參數(shù)D0 (平均致死劑量)、Dq(準(zhǔn)閾劑量)、N (外推值)、SF2(2 Gy劑量下對(duì)應(yīng)的存活分?jǐn)?shù)值)，k(細(xì)胞存活曲線的鈍化常數(shù))， SER(放射增敏比)。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞(5×104個(gè)·孔-1)接種96孔板中，并培養(yǎng)48 h。然后按照10 μL·孔-1加入CCK-8試劑，在37 ℃下再孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度(OD)值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)

每組取5×105個(gè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL 的FITC-Annexin V孵育細(xì)胞10 min，再加入與5 μL 的PI暗室內(nèi)孵育細(xì)胞15 min。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白樣品。使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用5%脫脂牛奶封閉后，用1:1000稀釋的抗CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax、GAPDH抗體在4 ℃孵育膜過夜。1:2500稀釋的二抗在37 ℃孵育膜2 h后，進(jìn)行增強(qiáng)發(fā)光顯色。Quantity One軟件掃描灰度值。GAPDH用作內(nèi)參，目的蛋白/內(nèi)參灰度比值表示每種蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

circular RNA Interactome預(yù)測(cè)到circ_0001982與miR-600存在特異結(jié)合位點(diǎn)，將含有miR-600結(jié)合位點(diǎn)的circ_0001982野生型序列或其突變型序列克隆到基本載體pLG3構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體WT-circ_0001982和MUT-circ_0001982。將MCF-7細(xì)胞鋪板于六孔板中，利用Lipofectamine 2000將WT-circ_0001982、MUT-circ_0001982分別與miR-con、miR-600 mimics共轉(zhuǎn)染，收獲轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ_0001982和miR-600在人乳腺癌組織中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的癌旁組織比較，乳腺癌組織中circ_0001982表達(dá)顯著升高(P<0.05)，miR-600表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。與MCF-10A細(xì)胞比較，MCF-7細(xì)胞中circ_0001982表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，miR-600表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 circ_0001982和miR-600在人乳腺癌組織中的表達(dá)

表2 circ_0001982和miR-600在人乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 circ_0001982對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞的circ_0001982表達(dá)量(0.98±0.01)較si-con組(1.67±0.02)顯著降低(t=30.900，P<0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同一照射劑量下，與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05)，SER為1.135。見圖1和表3。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞OD450值顯著降低(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞中CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，p21和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；在4 Gy照射劑量下，與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞的OD450值、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見表4和圖2。

放射劑量/Gy圖1 2組MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的比較

表3 單擊多靶模型參數(shù)

表4 抑制circ_0001982聯(lián)合4 Gy對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖2 抑制circ_0001982聯(lián)合4 Gy對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.3 circ_0001982與miR-600相互作用

circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示hsa_circ_0001982與miR-600存在連續(xù)互補(bǔ)核苷酸序列。見圖3。WT-circ_0001982和miR-600 mimics共轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性與WT-circ_0001982和miR-con共轉(zhuǎn)染比較顯著降低(P<0.05)，MUT-circ_0001982和miR-600 mimics共轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性與MUT-circ_0001982和miR-con共轉(zhuǎn)染比較無顯著變化。見表5。

圖3 circ _0001982與miR-600存在互補(bǔ)核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果

2.4 circ_0001982調(diào)控miR-600在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞中circ_0001982表達(dá)量顯著升高，miR-600表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)；與si-con組比較，si-circ_0001982組MCF-7細(xì)胞中circ_0001982表達(dá)量顯著降低，miR-600表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)。見表6。

表6 circ_0001982調(diào)控miR-600在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 miR-600過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，si-circ_0001982+miR-600組MCF-7細(xì)胞中miR-600表達(dá)量(1.56±0.03)較circ_0001982+miR-con組(0.64±0.03)顯著升高(t=21.510，P<0.05)。在同一照射劑量下，與circ_0001982+miR-con組比較，si-circ_0001982+miR-600組MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05)，SER為1.776。見圖4和表7。

放射劑量/Gy圖4 miR-600過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

表7 單擊多靶模型參數(shù)

與circ_0001982+miR-con組比較，si-circ_0001982+miR-600組MCF-7細(xì)胞OD450值、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；在4 Gy照射劑量下，與4 Gy+si-circ_0001982+miR-con組比較，4 Gy+si-circ_0001982+miR-600組MCF-7細(xì)胞OD450值、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見表8和圖5。

表8 miR-600過表達(dá)聯(lián)合4 Gy對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖5 miR-600過表達(dá)聯(lián)合4 Gy對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6 聯(lián)合抑制miR-600和circ_0001982表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞放射敏感性的影響

在同一照射劑量下，與si-circ_0001982+anti-miR-con組比較，si-circ_0001982+anti-miR-600組MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著升高(P<0.05)，SER為0.664。見圖6和表9。在4 Gy照射劑量下，與si-circ_0001982+anti-miR-con組比較，si-circ_0001982+anti-miR-600組MCF-7細(xì)胞OD450值、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見表10和圖7。

圖6 聯(lián)合抑制miR-600和circ_0001982表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響

表9 單擊多靶模型參數(shù)

表10 MCF-7細(xì)胞的增殖、凋亡的比較

A：細(xì)胞凋亡圖(流式細(xì)胞術(shù))；B：增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(western blot法)；1:4 Gy+si-circ_0001982+anti-miR-con組；2:4 Gy+si-circ_0001982+anti-miR-600組。

3 討論

越來越多研究[8-10]表明circRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤放射抵抗調(diào)控有關(guān)。例如，circ_000543在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)，且放射耐受患者中表達(dá)高于放射敏感患者，通過敲減circ_000543上調(diào)miR-9表達(dá)可降低鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗特性[8]。放療抵抗結(jié)腸癌組織中circ_0001313表達(dá)增加，抑制circ_0001313表達(dá)顯著降低照射下結(jié)腸癌細(xì)胞活力、克隆形成能力和caspase-3活性，進(jìn)而增加結(jié)腸癌放射敏感性[9]。此外，沉默circMTDH.4還可降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力以及和化療耐藥、放射抵抗特性[10]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織、MCF-7細(xì)胞中circ_0001982表達(dá)均顯著增加。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，抑制circ_0001982表達(dá)顯著降低MCF-7細(xì)胞活力、提高其凋亡率，增加其放射敏感性。這些結(jié)果表明，circ_0001982可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性。與本研究結(jié)果相類似是，DENG等[11]證實(shí)circ_0001982在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且抑制circ_0001982能顯著減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。Bax屬于Bcl-2家族促凋亡蛋白，其表達(dá)增加會(huì)觸發(fā)線粒體蛋白的釋放，從而切割并激活caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，抑制circ_0001982顯著下調(diào)Bcl-2、促增殖蛋白CyclinD1的表達(dá)，上調(diào)Bax、抗增殖蛋白p21的表達(dá)。這些結(jié)果提示，抑制circ_0001982可通過影響增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而降低乳腺癌細(xì)胞的活力、誘導(dǎo)其凋亡，進(jìn)而提高乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。

circRNAs作為miRNAs海綿參與調(diào)控基因表達(dá)在包括乳腺癌、胃癌等許多腫瘤的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[13-14]。然而circ_0001982是否通過調(diào)控miRNA表達(dá)發(fā)揮致癌作用并不清楚。本研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_0001982序列中存在miR-600結(jié)合位點(diǎn)，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了circ_0001982對(duì)miR-600的靶向負(fù)調(diào)控作用。既往研究[15-16]表明，miR-600可抑制結(jié)直腸癌、舌鱗癌等多腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。circPIP5K1A通過靶向miR-600促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[17]。此外，miR-600通過調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞自我更新和分化能力參與調(diào)控乳腺癌進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織、MCF-7細(xì)胞中miR-600表達(dá)均顯著降低；而且，過表達(dá)miR-600顯著下調(diào)MCF-7細(xì)胞中Bcl-2和CyclinD1蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax和p21蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡率，并增加其放射敏感性。同時(shí)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾miR-600表達(dá)顯著減弱了抑制circ_0001982表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞的抗增殖、促凋亡以及放射增敏作用。這些結(jié)果表明，circ_0001982在乳腺癌中的放射抵抗作用是通過靶向下調(diào)miR-600實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，抑制circ_0001982通過靶向miR-600能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加其放射敏感性，提示circ_0001982/miR-600途徑可能是乳腺癌放射增敏的潛在靶點(diǎn)。