鄭華山，陳成輝，蔡親平，林獻科，李 合

(海南醫(yī)學(xué)院a.第二附屬醫(yī)院東湖外科，?？?570311；b.第一附屬醫(yī)院普通外科，?？?70102)

食管癌是第八大常見腫瘤，癌癥死亡率居第六位[1]。食管癌有2種主要的組織學(xué)類型，即腺癌和鱗狀細(xì)胞癌。食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是我國食管癌患者的主要患病類型，5年成活率低[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200 nt的RNA分子[3]，其在各種生理、病理發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其中癌癥易感性候選基因9(CASC9)對各種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起重要作用。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，lncRNA在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)并促進結(jié)直腸癌發(fā)展，lncRNA還參與頭頸部癌癥的轉(zhuǎn)移[5]。microRNA(miRNAs)是單鏈非編碼小RNA片段，通過與mRNA靶標(biāo)的3′端未翻譯區(qū)域序列特異性相互作用而發(fā)揮抑制翻譯的作用并調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達，參與多種腫瘤進程。miR-424-5p具有抑癌作用，抑制食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移以及調(diào)控食管癌細(xì)胞的G1/S和G2/M細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變[6-7]。有研究[8]表明，lncRNA-miRNA-mRNA相互作用與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是lncRNA-miR-424-5p共表達網(wǎng)絡(luò)在食管鱗癌中發(fā)揮的作用暫且未知。本研究構(gòu)建lncRNA、miRNA、mRNA調(diào)控和共表達網(wǎng)絡(luò)，探討lncRNA CASC9通過調(diào)控miR-424-5p/SOX9分子軸對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源

收集2017年3月至2020年3月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院手術(shù)切除的40例食管鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織標(biāo)本和35例癌旁正常組織標(biāo)本。術(shù)前所有患者均知曉該研究，并簽署知情同意書，術(shù)后立即將腫瘤組織和配對的癌旁組織液氮儲存。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)符合食管癌診療規(guī)范(2018年版)食管鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)在本院進行食管鱗癌切除術(shù)，食管鱗癌腫瘤標(biāo)志物呈陽性患者；3)能夠并愿意遵守研究方案操作。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)不同意采集標(biāo)本的患者；2)有影響實驗結(jié)果解釋的其他惡性腫瘤史的患者；3)有免疫系統(tǒng)疾病的患者。

1.1.2 試劑

食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(KYSE150、KYSE450、EC109、EC9706)以及正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞株(Het-1A)來自于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM高培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，si-CASC9質(zhì)粒、si-SOX9質(zhì)粒(北京擎科生物有限公司)，miRNA-424-5p mimics(Genepharma公司)，CCK-8試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，Transwell室(美國HyClone公司)，一抗、二抗(英國Abcam公司)，Cell Cycle試劑盒(美國Millipore&Billerica公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將KYSE150、KYSE450、EC109、EC9706及Het-1A細(xì)胞置于DMEM高培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2的飽和濕化培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測組織和細(xì)胞系中CASC9和miR-424-5p的表達

RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將CASC9和miR-424-5p分別轉(zhuǎn)錄為cDNA，取適量cDNA配置PCR反應(yīng)體系。采用GAPDH作為內(nèi)參，檢測CASC9和miR-424-5p相對表達量。反應(yīng)體系總量20 μL。cDNA產(chǎn)物2 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。測定模板的Ct值，循環(huán)數(shù)法(2-ΔΔCt)定量相對表達量。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選用對數(shù)生長期KYSE450細(xì)胞進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，使用胰酶消化后，接種至6孔板中，每孔含2 mL細(xì)胞懸液(1×105個細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h。隨后，按照LipofectamineTM 2000試劑盒說明書將si-CASC9、miRNA-424-5p mimics、miRNA-424-5p mimics+CASC9、miRNA-424-5p mimics+SOX9以及CASC9+si-SOX9轉(zhuǎn)染到KYSE450細(xì)胞中，48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.5 CCK-8檢測KYSE450細(xì)胞增殖活力

采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將對數(shù)生長期的KYSE450細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板，每孔含細(xì)胞懸液100 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 d，并于每天同一時間在每孔分別加入10 μL CCK-8試劑，使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度，按照CCK-8試劑盒說明書分析細(xì)胞活力。實驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell檢測KYSE450細(xì)胞侵襲能力

根據(jù)制造商的指示使用Transwell室(孔隙大小8 μm)。細(xì)胞生長至亞融合(約75%～80%)，血清饑餓24 h。胰蛋白酶分離后，PBS洗滌細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中復(fù)蘇。接下來，100 μL細(xì)胞懸液(5×104cells·mL-1)添加到上室。將基質(zhì)凝膠涂層添加到小室的底部。24 h后，使用棉簽將沒有侵襲的細(xì)胞從過濾器的表面去除，侵襲的細(xì)胞用5%戊二醛溶液固定，以確定侵襲細(xì)胞的數(shù)量。濾光片的下表面用0.25%臺盼藍(lán)染色。采集每個膜上6個不同視野的圖像(×40)，統(tǒng)計侵襲細(xì)胞數(shù)，并計算侵襲細(xì)胞的數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測周期相關(guān)蛋白及SOX9蛋白表達情況

收集各組待檢驗KYSE450細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗3次，分別加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg進行10%SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶，根據(jù)Marker切取目的條帶，將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗(1:1500)4 ℃孵育過夜。棄去一抗，TBST洗滌3次后加入二抗(1:2000)室溫孵育2 h，TBST再次清洗3次后進行ECL染色，隨后在凝膠成像儀上觀察，實驗重復(fù)3次。Image J軟件分析蛋白條帶。

1.8 雙熒光素酶報告基因驗證miR-424-5p與CASC9或SOX9的靶向關(guān)系

將野生型CASC9和突變型CASC9分別插入pmirGLO報告載體。利用Lipofectamine 2000將miR-424-5p模擬物與野生型CASC9或突變型CASC9共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，在雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)上測定相對熒光素酶活性。同法轉(zhuǎn)染SOX9，測定相對熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性的比值。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測KYSE450細(xì)胞周期

收集各組待檢驗KYSE450細(xì)胞，1 mL 0.25%胰酶消化后加入PBS終止消化，移液槍輕輕吹打細(xì)胞使細(xì)胞懸浮，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1500 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，棄去上清液。隨后加入3 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1500 r·min-1離心5 min，棄上清，沉淀震蕩混勻。隨后用-20 ℃ 75%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃固定過夜。次日，加入2 mL PBS混勻，1500 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，PBS重懸，離心收集細(xì)胞，隨后用100 μL PBS重懸細(xì)胞。加入2 μL RNaseA(1 mg·mL-1)，37 ℃水浴40 min。隨后加入100 μL PI染色液，避光染色20 min，所有操作按照Cell Cycle試劑盒說明書進行。使用流式細(xì)胞儀測定G1、S期細(xì)胞百分比。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理分析，采用t檢驗或單因素ANOVA法分析計算2組樣本或多組樣本間的差異顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC9在ESCC組織及細(xì)胞系中高表達

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，CASC9在ESCC組織中的表達為(0.26±0.47)，明顯高于癌旁組織的(0.09±0.45)(P<0.01，圖1A)。CASC9在EC109、EC9706、KYSE150、KYSE450中的表達分別為(0.54±0.71)、(1.25±0.33)、(2.04±0.39)、(3.08±0.84)，均顯著高于Het-1A細(xì)胞的(0.23±0.38)，且在KESE450中表達最高(P<0.01，圖1B)。

2.2 敲降CASC9抑制KYSE450細(xì)胞增殖、侵襲，阻滯細(xì)胞周期G1/S期

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組(NC組)比較，敲降CASC9(si-CASC9組)能顯著降低CASC9在KYSE450細(xì)胞中的表達(P<0.01，圖2A)；CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，敲降CASC9可顯著抑制KYSE450細(xì)胞增值活力(P<0.01，圖2B)；Transwell實驗結(jié)果顯示，與NC組比較，敲降CASC9可顯著抑制KYSE450細(xì)胞侵襲能力(P<0.01，圖2C—D)；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，敲降CASC9可顯著上調(diào)G1期細(xì)胞數(shù)，下調(diào)S期細(xì)胞數(shù)(P<0.01，圖2E)；Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，敲降CASC9明顯下調(diào)了KYSE450細(xì)胞中G1期和S期細(xì)胞周期蛋白(CCND1、CCNA、CDK4、CDK6)的表達(P<0.01，圖2F—G)。由此可知，敲降CASC9可降低CASC9在KYSE450細(xì)胞中的表達水平，顯著抑制KYSE450細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞G1/S期阻滯。

2.3 lncRNA CASC9靶向調(diào)控miR-424-5p/SOX9分子軸

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase V2.0預(yù)測miR-424-5p可能是lncRNA CASC9的靶基因，其預(yù)測序列見圖3A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達miR-424-5p使熒光素酶活性降低(P<0.01，圖3B)，而共轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics和靶向位點發(fā)生突變的pmirGLO-CASC9-MUT載體，miR-424-5p對熒光素酶活性的抑制作用喪失(P>0.05，圖3B)，由此可知miR-424-5p是lncRNA CASC9的靶基因。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，敲降CASC9可明顯上調(diào)miR-424-5p表達水平(P<0.01，圖3C)，表明miR-424-5p是lncRNA CASC9的靶基因。

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase V2.0預(yù)測miR-424-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)SOX9是miR-424-5p的候選靶基因，其結(jié)合序列如圖3D。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達miR-424-5p使熒光素酶活性降低(P<0.01，圖3E)，而共轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics和靶向位點發(fā)生突變的pmirGLO-SOX9-MUT載體，miR-424-5p對熒光素酶活性的抑制作用喪失(P>0.05，圖3E)；Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達miR-424-5p抑制SOX9的表達(P<0.01，圖3F—G)。由此可知SOX9是miR-424-5p的靶基因。

2.4 lncRNA CASC9通過調(diào)控miR-424-5p/SOX9分子軸影響KYSE450細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

Western blotting檢測結(jié)果顯示，單獨過表達miR-424-5p抑制SOX9在KYSE450細(xì)胞中的表達(P<0.01)，回復(fù)組(miRNA-424-5p mimics+CASC9組、miRNA-424-5p mimics+SOX9組及CASC9+si-SOX9組)顯著回復(fù)單獨過表達miR-424-5p對SOX9表達的抑制作用(P<0.01)，回復(fù)組與NC組SOX9表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4A—B。CCK-8和Transwell實驗結(jié)果顯示，單獨過表達miR-424-5p顯著抑制KYSE450細(xì)胞增殖和侵襲(P<0.01)，而回復(fù)組則顯著下調(diào)單獨過表達miR-424-5p對KYSE450細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用(P<0.01)，見圖4C—E。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，單獨過表達miR-424-5p顯著上調(diào)G1期細(xì)胞數(shù)(P<0.01)，下調(diào)S期細(xì)胞數(shù)(P<0.01)，而回復(fù)組則顯著下調(diào)單獨過表達miR-424-5p對細(xì)胞G1期和S期的調(diào)控作用(P<0.01)，見圖4F—G。Western blotting結(jié)果顯示，單獨過表達miR-424-5p顯著抑制周期蛋白(CCND1、CCNA、CDK4、CDK6)表達(P<0.01)，而回復(fù)組則顯著下調(diào)單獨過表達miR-424-5p對周期蛋白的抑制作用(P<0.01)，見圖4H—L。以上結(jié)果表明，lncRNA CASC9可以通過靶向下調(diào)miR-424-5p對SOX9表達的抑制作用，進而抑制KYSE450細(xì)胞增殖，侵襲，并調(diào)控細(xì)胞周期。

3 討論

ESCC在亞洲國家占食管癌患者的90%，且發(fā)病率一直在上升，我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一[9]。在亞洲和西方國家，新輔助化療或新輔助放化療加食管癌切除術(shù)已成為局部晚期食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)初始治療方法。雖然新輔助化療和新輔助放化療已逐步改善，但由于局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，局部晚期ESCC 5年生存率仍為37%～55%[10]。因此，找尋新的方法抑制ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲具有重要意義。

lncRNA包括一類長度>200 nt的轉(zhuǎn)錄本，不作為蛋白質(zhì)合成的模板[11]。lncRNA信號在異常表達時參與腫瘤發(fā)生，與腫瘤行為和預(yù)后相關(guān)[12]。大量研究[13-16]表明，CASC9對各種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起重要作用。CASC9在口腔鱗癌組織中高表達，通過激活A(yù)KT/mTOR通路抑制自噬，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。CASC9在胃癌組織中高表達，促進細(xì)胞生長，對胃癌中的紫杉醇和多柔比星產(chǎn)生耐藥[14]。CASC9在體外促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生，還參與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子水平[15]。CASC9促進了血管瘤的細(xì)胞生長和侵襲，為血管瘤的診斷和分子治療提供了新的思路[16]。上述研究提示CASC9能夠作為癌基因參與調(diào)控癌癥的發(fā)展。本研究采用RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)CASC9在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(KYSE150、KYSE450、EC109、EC9706)中的表達量不同，筆者猜想CASC9在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達高低可能存在細(xì)胞特異性，但筆者重點關(guān)注的是CASC9在ESCC組織中高表達，且在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株表達水平均高于Het-1A細(xì)胞，提示CASC9的異常表達可能與ESCC發(fā)展有關(guān)。進一步通過CCK-8、Transwell實驗檢測ESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)敲降CASC9顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖和侵襲，這與之前的研究結(jié)果一致，說明CASC9在ESCC發(fā)展中也發(fā)揮了明顯的促癌作用。

細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)在細(xì)胞維持正常生命活動的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)出現(xiàn)異常時，細(xì)胞往往會發(fā)生癌變。細(xì)胞進入增殖周期后會激活CDK4/CDK6等蛋白激酶，與Cyclin D1結(jié)合形成具有活性的復(fù)合體，使細(xì)胞從G1期進入S期。在此過程中，CDK4/CDK6失活后，會使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。而CCND1、CCNA、CCNB1等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子也在細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)敲降CASC9顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖、侵襲，進一步檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)下調(diào)CASC9明顯誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。說明下調(diào)CASC9通過使細(xì)胞中CCND1、CCNA、CDK4和CDK6表達下調(diào)，阻礙細(xì)胞周期正常運轉(zhuǎn)，促進細(xì)胞癌變。研究表明microRNAs(miRNAs)通過阻斷一組或多組mRNA的翻譯或促進其降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，在正常生理和病理條件下是細(xì)胞表型的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]。越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)miR-424-5p與各種癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。如miR-424-5p在肝癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，病理分級越高、TNM分期越晚的患者miR-424-5p表達水平越低[18]。miR-424-5p通過針對SMAD3/TGF-β信號通路促進胃癌細(xì)胞增殖[19]。miR-424-5p在卵巢癌組織和細(xì)胞系中表達下調(diào)，并通過E2F1-pRB通路靶向CCNE1調(diào)控卵巢癌的增殖、細(xì)胞周期[20]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-424-5p是CASC9的靶基因，隨后發(fā)現(xiàn)敲降CASC9明顯增強miR-424-5p的表達水平，結(jié)果提示CASC9通過靶向和負(fù)調(diào)節(jié)miR-424-5p進一步調(diào)控了ESCC細(xì)胞的增殖和侵襲。

SOX9是性別決定區(qū)Y家族成員，控制廣泛的轉(zhuǎn)錄程序的建立，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和上皮-中央?yún)^(qū)(ETM)轉(zhuǎn)化中的發(fā)育作用有關(guān)[21-22]。LEUNG等[23]的研究結(jié)果表明，SOX9在肝癌組織中高表達，SOX9轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)與腫瘤細(xì)胞分化較差、靜脈侵犯、腫瘤晚期和總生存期較短有關(guān)，并通過Wnt/β-catenin通路賦予干細(xì)胞特性。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CSOX9是miR-424-5p的靶基因，并通過CCK-8、Transwell法和Western blot法發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC9可以通過靶向下調(diào)miR-424-5p對SOX9表達的抑制作用，進而抑制KYSE450細(xì)胞增殖、侵襲，并調(diào)控細(xì)胞周期。

綜上，lncRNA CASC9可通過抑制miR-424-5p/SOX9分子軸的表達，抑制ESCC細(xì)胞增殖、侵襲，并調(diào)控細(xì)胞周期，可能作為食管鱗狀細(xì)胞癌患者治療的新型靶點，值得進一步深入研究。