李銀輝，胡海燕，丁家榮，朱 超，袁繼行，郭志勇

(海軍軍醫(yī)大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科； b.遺傳教研室，上海 200433)

腎結(jié)石是全球范圍內(nèi)的臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，其全球年發(fā)病率為3%～5%，人類(lèi)終生發(fā)病率為15%～25%[1]，現(xiàn)已成為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)和終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)的重要危險(xiǎn)因素[2]。隨著微創(chuàng)外科技術(shù)的發(fā)展，泌尿道結(jié)石的外科治療雖然取得較大進(jìn)展，但首次治療后結(jié)石在5～10年內(nèi)的復(fù)發(fā)率超過(guò)50%，20年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)75%[1]。尿路結(jié)石成分分析顯示，超過(guò)80%患者的結(jié)石主要成分為草酸鈣，且以一水草酸鈣(calcium oxalate monohydrate，COM)為主[3]。結(jié)晶是結(jié)石的早期階段，正常人尿液中也有大量的結(jié)晶形成，一般情況下結(jié)晶在小管內(nèi)停留的時(shí)間不足以使其生長(zhǎng)到堵塞腎小管，只有在小管上皮細(xì)胞存在損傷的情況下結(jié)晶才有可能粘附于腎小管上皮細(xì)胞從而滯留于腎臟，然后逐漸發(fā)展成為結(jié)石[4-5]，因而腎小管上皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是結(jié)石形成的前提和起始點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長(zhǎng)度超過(guò)200 bp而無(wú)編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，但在腫瘤和非腫瘤性疾病中均發(fā)揮重要生物功能。近來(lái)有研究[6-7]表明LncRNA在結(jié)石病和CKD領(lǐng)域中也發(fā)揮重要調(diào)控作用。LncRNA-ATB是被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)活化的一條lncRNA，前期研究[8]顯示其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA-200家族促進(jìn)鋅指E-盒結(jié)合蛋白1/2(ZEB1/2)的表達(dá)，從而調(diào)控肝癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過(guò)程。而TGF-β是腎臟纖維化過(guò)程中最為關(guān)鍵的調(diào)控因子[9]，在草酸鈣結(jié)晶性腎損傷過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[10]，但lncRNA-ATB在結(jié)晶性腎損傷中的功能尚未明了。本研究旨在以COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞為模型探討lncRNA-ATB對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷、增殖抑制和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑

人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購(gòu)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。COM結(jié)晶購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；Trizol溶液、TB Green Premix Ex Taq、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)于日本TaKaRa公司；PCR和逆轉(zhuǎn)錄引物由上海杰李生物合成；CCK-8試劑盒和LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Dojindo公司；PBS購(gòu)于上海博光生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒、RIPA裂解液、蛋白上樣緩沖液、無(wú)蛋白封閉液購(gòu)于上海雅酶生物科技有限公司；GAPDH抗體(MAB374)購(gòu)于美國(guó)默克公司；N-cadherin抗體(ab18203)和ZO-1抗體(ab61357)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；E-cadherin抗體(3195)和Vimentin抗體(3390)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；二抗購(gòu)于武漢Proteintech公司；PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。COM結(jié)晶在180 ℃烤箱中烘烤過(guò)夜滅菌后，加入DMEM/F12培養(yǎng)基中，用滅菌磁力攪拌器攪拌2 h制成規(guī)定濃度的混懸液。應(yīng)用200 μg·mL-1COM混懸液替換正常培養(yǎng)基培育HK-2細(xì)胞48 h構(gòu)建草酸鈣結(jié)晶性腎損傷的細(xì)胞模型。

1.2.2 干擾LncRNA-ATB穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

LncRNA-ATB干擾慢病毒及對(duì)照慢病毒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建病毒載體及包裝，干擾序列見(jiàn)表1，由海軍軍醫(yī)大學(xué)遺傳教研室袁繼行副教授提供。為了得到相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，相應(yīng)慢病毒感染HK-2細(xì)胞，48 h后開(kāi)始應(yīng)用嘌呤霉素(6 μg·mL-1)篩選細(xì)胞，篩選2周后進(jìn)行鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)。

表1 shRNA干擾序列

1.2.3 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行三步法反轉(zhuǎn)錄cDNA，其中制備用于lncRNA-ATB定量檢測(cè)的cDNA時(shí)需使用專(zhuān)用的逆轉(zhuǎn)錄引物替換隨機(jī)引物。應(yīng)用SYBR Green酶在Applied Bio-systems PCR儀器上行2-ΔΔCT法定量檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列見(jiàn)表2。

表2 逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR引物序列

1.2.4 Western-blot檢測(cè)

HK-2細(xì)胞干預(yù)后用PBS清洗，冰上RIPA裂解變性制備上樣液，雅酶預(yù)制膠凝膠(10%)進(jìn)行蛋白電泳，200 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上，應(yīng)用無(wú)蛋白快速封閉液室溫封閉15 min，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，洗滌后于室溫避光搖床上孵育二抗1～2 h，再次洗滌后于Odyssey掃描儀上進(jìn)行掃膜并分析蛋白條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)

各穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞8000 個(gè)·孔-1種植于96孔板，次日更換含有/無(wú)COM(200 μg·mL-1)的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12、24、36和48 h 后在每孔加入CCK-8工作液10 μL，繼續(xù)孵育2 h，Bio Tek酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值，應(yīng)用試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法計(jì)算細(xì)胞增殖比例。

1.2.6 LDH實(shí)驗(yàn)

采用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)分3組：A.實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞+COM)；B.高對(duì)照組(細(xì)胞+裂解液)；C.低對(duì)照組(無(wú)任何特殊處理的細(xì)胞)。每組均設(shè)背景對(duì)照孔，每孔8000個(gè)細(xì)胞種植于96孔板，次日更換含有/無(wú)COM(200 μg·mL-1)的培養(yǎng)基培育48 h。然后在高對(duì)照組孔中加入試劑盒中的10 μL裂解液后培養(yǎng)箱孵育30 min；隨后每孔均加入試劑盒提供的100 μL工作液，孵育20 min；每孔加入50 μL終止液，立即用Bio Tek酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm處檢測(cè)OD值，各組實(shí)際OD值為測(cè)得值減去背景對(duì)照孔的OD值，計(jì)算COM對(duì)細(xì)胞的損傷百分比：細(xì)胞損傷率 (%) = (A-C)/(B-C)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；2組間比較采用雙側(cè)Student’st檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-ATB在HK-2細(xì)胞中表達(dá)的比較

qRT-PCR檢測(cè)不同濃度(100、200、400、800 μg·mL-1)COM孵育48 h及與200 μg·mL-1COM孵育不同時(shí)間(12、24、36、48、60和72 h)后HK-2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-ATB的表達(dá)水平，結(jié)果顯示COM呈一定濃度和時(shí)間依賴(lài)性增加lncRNA-ATB的表達(dá)，在COM質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1和處理48 h時(shí)達(dá)到峰值。見(jiàn)圖1。

*P<0.05、**P<0.01與0 μg·mL-1組或0 h組比較。圖1 lncRNA-ATB在不同作用時(shí)間HK-2細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT

HK-2細(xì)胞經(jīng)200 μg·mL-1COM處理48 h后，其原有的鵝卵石樣上皮細(xì)胞形態(tài)丟失，代之以梭型的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，觸角增多變長(zhǎng)、成八爪魚(yú)樣；且COM組細(xì)胞數(shù)量顯著低于Control組。見(jiàn)圖2。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，COM刺激后HK-2細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin(E-cad)和ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)均降低(均P<0.01)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin(N-cad)和vimentin(Vim)的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖2 倒置顯微鏡下HK-2細(xì)胞的形態(tài)(100×)

A：qRT-PCR檢測(cè)各組標(biāo)志物的mRNA表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)各組標(biāo)志物的蛋白表達(dá)。**P<0.01與Control組比較。

2.3 干擾lncRNA-ATB表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞損傷和增殖抑制的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，兩個(gè)干擾位點(diǎn)(sh-ATB1和sh-ATB2)均明顯降低了lncRNA-ATB的表達(dá)。見(jiàn)圖4A。LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，COM誘導(dǎo)了HK-2細(xì)胞的損傷，而干擾lncRNA-ATB表達(dá)顯著緩解COM所致的細(xì)胞損傷。見(jiàn)圖4B。CCK-8結(jié)果顯示，COM刺激抑制HK-2細(xì)胞的增殖，而lncRNA-ATB干擾后細(xì)胞的增殖增強(qiáng)。見(jiàn)圖4C。

A：qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞lncRNA-ATB的表達(dá)；B：LDH檢測(cè)各組細(xì)胞的損傷；C：CCK8-檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖。**P<0.01與sh-NC+COM組比較； ##P<0.01與sh-NC+COM組比較。

2.4 干擾lncRNA-ATB表達(dá)對(duì)COM誘導(dǎo)EMT的影響

如圖5所示，sh-ATB1+COM組和sh-ATB2+COM組細(xì)胞lncRNA-ATB表達(dá)被干擾后，COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞呈梭形、八爪魚(yú)狀的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變較sh-NC+COM組顯著減少；且兩干擾組細(xì)胞數(shù)量均明顯多于sh-NC+COM組。檢測(cè)細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)水平顯示，sh-ATB1+COM組和sh-ATB2+COM組細(xì)胞由COM刺激誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的改變與sh-NC+COM組比較也得到顯著逆轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖6。

圖5 倒置顯微鏡下各組HK-2細(xì)胞的形態(tài)(100×)

A：qRT-PCR檢測(cè)；B：Western blot檢測(cè)。**P<0.01與sh-NC組比較； #P<0.05、##P<0.01與sh-NC+COM組比較。

3 討論

近年研究[2]表明腎結(jié)石是CKD和ESRD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腎內(nèi)結(jié)晶是腎結(jié)石的早期階段，當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)腎內(nèi)結(jié)晶可能粘附于腎小管上皮細(xì)胞，從而滯留于腎臟[4]。而草酸鈣結(jié)晶粘附于腎小管上皮細(xì)胞后通過(guò)氧化應(yīng)激等途徑加重細(xì)胞損傷，同時(shí)損傷的腎小管上皮細(xì)胞釋放出TNF-α、TGF-β、MCP-1等眾多炎癥因子，從而趨化外周單核細(xì)胞到損傷部位，然后在腎小管上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞協(xié)同作用下結(jié)晶被轉(zhuǎn)移到腎臟間質(zhì)中；另外，被激活的單核/巨噬細(xì)胞一方面能夠吞噬并清除少量結(jié)晶，但更多單核/巨噬細(xì)胞受到晶體刺激后發(fā)生損傷，并不能完全溶解清除結(jié)晶，最終只能包繞結(jié)晶形成肉芽腫樣組織，為結(jié)石發(fā)生發(fā)展提供巢核[11]，從而促進(jìn)結(jié)石的形成。在本研究中，HK-2細(xì)胞經(jīng)COM刺激后發(fā)生顯著的損傷，其增殖也明顯被抑制，與本課題組前期研究結(jié)果一致[12-13]。

腎組織纖維化是包括結(jié)石在內(nèi)各種因素所致CKD以及最終進(jìn)展為ESRD的共同病理生理基礎(chǔ)[14]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，即使應(yīng)用外科手段解除了結(jié)石的梗阻和刺激仍不能終止腎功能的損害和纖維化的進(jìn)程。EMT是腎臟纖維化關(guān)鍵的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[9]。BOONLA等[15]和LIU等[16]先后通過(guò)結(jié)石患者的病理組織證實(shí)EMT參與結(jié)石的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)，在草酸鈣結(jié)晶性腎損傷早期就可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞的損傷和EMT的發(fā)生，并啟動(dòng)纖維化的進(jìn)程。在本研究中，與COM刺激后HK-2細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)明顯梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，觸角增多變長(zhǎng)，成八爪魚(yú)樣；同時(shí)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1的表達(dá)明顯降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著上升，表明COM可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，可能是COM導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的重要方式之一。

近來(lái)研究[6]表明lncRNA在結(jié)石病和CKD領(lǐng)域的研究中也發(fā)揮重要作用。例如，SONG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA LINC00339通過(guò)miR-22-3p/NLRP3軸促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)HK-2的細(xì)胞焦亡。本課題組前期研究[12]也發(fā)現(xiàn)lncRNA HOXA11-AS通過(guò)miR-124/MCP-1調(diào)控結(jié)晶性腎損傷過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。LncRNA-ATB是被TGF-β活化的一條lncRNA，前期研究證實(shí)其能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA-200家族調(diào)控肝癌的EMT過(guò)程[8]。而TGF-β是腎臟炎癥和纖維化最為重要的細(xì)胞因子[18]，同樣在草酸鈣結(jié)晶性腎損傷過(guò)程也發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示，在COM刺激HK-2細(xì)胞模型中，lncRNA-ATB表達(dá)水平顯著升高，而干擾lncRNA-ATB表達(dá)后明顯改善了HK-2細(xì)胞的間質(zhì)化細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)志物的改變；同時(shí)干擾lncRNA-ATB能夠緩解COM刺激導(dǎo)致細(xì)胞損傷和增殖抑制?；谇捌诘难芯砍晒鸞8,10]，筆者推測(cè)其機(jī)制可能為COM刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞TGF-β表達(dá)水平升高，從而活化了lncRNA-ATB基因使其表達(dá)水平升高，然后lncRNA-ATB可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)吸附miR-200家族促進(jìn)EMT進(jìn)展，確切機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，lncRNA-ATB在草酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中高表達(dá)，其通過(guò)促進(jìn)COM誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、增殖抑制和EMT，可能參與調(diào)控草酸鈣結(jié)晶性腎損傷。