王明明 王磊 竇芳 李韋韋 文愛東 王婧雯

摘 要 目的：研究β-乳香酸對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷的改善作用。方法：將大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為正常對照組、模型組和β-乳香酸低、中、高濃度組（1、10、100 μmol/L），除正常對照組外，其余各組細(xì)胞加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，并進(jìn)行氧糖剝奪培養(yǎng)以復(fù)制氧糖剝奪損傷模型。采用MTT法檢測細(xì)胞的存活率，采用化學(xué)比色法檢測細(xì)胞上清液中乳糖脫氫酶（LDH）活性，采用Hoechst-PI染色法觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率，采用Western blot法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白[B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）]的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），細(xì)胞上清液中LDH活性、細(xì)胞早期凋亡率和細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著降低 （P<0.05或P<0.01）;細(xì)胞核致密濃染、碎片狀現(xiàn)象明顯減少。結(jié)論：β-乳香酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 β-乳香酸;海馬神經(jīng)元細(xì)胞;氧糖剝奪;細(xì)胞凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of β-boswellic acid on hippocampal neurons cells injury of rats induced by oxygen-glucose deprivation. METHODS： The hippocampal neurons cell of rats were divided into normal control group， model group and β-boswellic acid low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （1， 10， 100 μmol/L）. Except for normal control group， other groups were cultured with relevant medium and given oxygen glucose deprivation to induce oxygen-glucose deprivation induced injury model. MTT assay was adopted to detect cell viability. Chemical colorimetry was used to detect LDH activity in cell culture supernatant. Hoechst-PI staining was used to detect the morphology change of cells. Flow cytometry was used to detect early apoptosis rate of cells. The expression of apoptosis-related protein （Bcl-2， Bax and cleaved caspase-3） were detected by Western blot. RESULTS： Compared with model group， the survival rate of cells and protein expression of Bcl-2 were increased significantly in β-boswellic acid medium-concentration and high-concentration groups （P<0.01）， while LDH activity， early apoptosis rate， protein expression of cleaved caspase-3 and Bax were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The densely stained nuclei and fragmentation decreased significantly. CONCLUSIONS： β-boswellic acid can relieve oxygen-glucose deprivation induced injury of hippocampal neurons cells， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of cleaved caspase-3 and Bax and up-regulating the protein expression of Bcl-2.

KEYWORDS? ?β-boswellic acid; Hippocampal neurons cells; Oxygen-glucose deprivation; Cell apoptosis

腦卒中是引起人類死亡和殘疾的第二大病因，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響國民健康;其中，80%的患者為缺血性卒中[1]。缺血性腦卒中是因大腦動脈血流短暫或持久性的閉塞導(dǎo)致腦供血不足或中斷，進(jìn)而誘發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，造成缺血區(qū)腦組織不可逆的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺陷[2]。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是腦組織中對缺血缺氧最敏感的部位之一[3-4]，因此，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可有效減輕缺血性腦損傷的程度，進(jìn)而防治缺血性腦卒中[5]。

乳香為橄欖科植物乳香樹 Boswellia carterii Birdw.及同屬B. bhaur dajiana Birdw.樹皮滲出的樹脂，目前已被歐洲藥品管理局列為治療腦癌水腫的潛在治療藥物[6]，其中β-乳香酸是其重要的藥效物質(zhì)[7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，β-乳香酸可促進(jìn)海馬神經(jīng)元的生長和分支;另外，其在大鼠腦組織中的濃度明顯高于乳香的其他藥效成分，具有較高的血腦屏障滲透率[8-9]。但β-乳香酸是否對缺血性腦卒中具有治療作用，尚不明確。

基于此，本研究以大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞為研究對象，建立氧糖剝奪損傷模型，通過檢測細(xì)胞凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白[B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）]的表達(dá)，探討β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷的改善作用，以期為β-乳香酸防治缺血性腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：HF-90型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），IX53型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），ELX-800型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），H-2050R型超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），NW10LVF型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），DYY-7C型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司），NovoCyte型流式細(xì)胞儀（艾森生物有限公司），DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：β-乳香酸（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號P1513，純度不低于95%），胰蛋白酶（上海中喬新舟生物科技有限公司，批號0103），DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號SH30027），胎牛血清（以色列BI公司，批號04-011-1A），Neurobasal培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27（美國Gibco公司，批號分別為12348-017、25030-149、17504-044），阿糖胞苷（日本TCI公司，批號C2035），磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、蛋白上樣緩沖液、碘化丙啶（PI）、細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為ST476、ST038、P0015、ST511、P0013、P0018），MTT試劑、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、兔抗大鼠cleaved caspase-3單克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2 單克隆抗體、兔抗大鼠Bax單克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，批號分別為WLA021、WLA072、WLA004、WLA001、WLA023、WL02117、WL01556、WL01637、WL01372）。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD新生大鼠（出生2天），雄性，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（陜）2019-001。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±1） ℃、濕度為45%～55%，飼養(yǎng)過程中大鼠自由進(jìn)食飲水。

2 方法

2.1 原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[10]并對方法改良后進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)。取新生大鼠，置于 75%乙醇中浸泡5 min，于無菌條件下取出其腦組織，分離海馬組織，以PBS洗凈殘血后剪碎，放入無菌離心管中，加入0.125%胰蛋白酶，于37 ℃條件下水浴5 min進(jìn)行消化;將消化后的混懸液反復(fù)吹打溶液，靜置，待自然沉淀后棄去上清液;沉淀中加入0.125%胰蛋白酶繼續(xù)消化，待自然沉淀后收集上清液;然后向上清液中加入含10%胎牛血清和青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基以中和消化酶，然后以70 μm孔徑的一次性細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，取上清液，以1 000 r/min離心7 min，棄上清液;將沉淀接種至多聚賴氨酸包被的6孔板中，于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)8 h后，換成含2%B27和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺及100 U/mL青/鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，每隔3 天換液1次，培養(yǎng)7～10天后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 海馬神經(jīng)元細(xì)胞分組、造模與給藥

取海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為正常對照組、模型組和β-乳香酸不同濃度組（1、10、100 μmol/L，濃度根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]設(shè)置）。正常對照組和模型組加入含2%B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基1 mL;β-乳香酸各濃度組加入含相應(yīng)藥物以及含2%B27和0.5 mmol/L? ?L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基1 mL。各組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，將β-乳香酸各濃度組和模型組的培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于缺氧造模盒內(nèi)，通入混合氣體（含有95%N2、5%CO2），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h以誘導(dǎo)建立氧糖剝奪模型[13-14];正常對照組繼續(xù)用含2%B27和0.5 mmol/L谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，不作缺氧缺糖處理。造模結(jié)束將各組培養(yǎng)基更換為含2%B27和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基（β-乳香酸各濃度組繼續(xù)加入相應(yīng)藥物）。

2.3 海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率的測定

采用MTT法進(jìn)行檢測。取“2.1”項(xiàng)下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，然后按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，加入MTT染色液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去上清液，加入DMSO 150 μL以溶解細(xì)胞，避光靜置10 min后，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長下測定各孔吸光度值（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組/OD正常對照組）×100%]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LDH活性的測定

采用化學(xué)比色法進(jìn)行檢測。取“2.1”項(xiàng)下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，然后按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液上清液，根據(jù)LDH測定試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀于440 nm波長處測定各孔OD，并計(jì)算LDH 活性。

2.5 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的觀察

采用Hoechst-PI染色法進(jìn)行觀察。取“2.1”項(xiàng)下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以5×103個/孔接種于置有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，滴加Hoechst熒光染料（10 μg/mL），于37 ℃條件下孵育10 min;以PBS清洗3次，加入1 μg/mL PI，于4 ℃條件下孵育20 min;滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min;以 PBS清洗3次，然后采用熒光倒置顯微鏡觀察（正常細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色后呈淡藍(lán)色圓形狀，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色后呈亮藍(lán)色分葉、碎片狀;死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞因細(xì)胞膜被破壞，可被PI染成亮紅色[15]）。

2.6 海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率的檢測

取“2.1”項(xiàng)下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以5×103個/孔接種于具有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，以PBS清洗2次，棄上清液;加入Binding buffer 500 μL輕輕重懸細(xì)胞;加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，再加入PI 10 μL，室溫避光孵育15 min，然后采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞早期凋亡率。

2.7 海馬神經(jīng)元細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.1”項(xiàng)下海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以5×103個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，以PBS沖洗3次，加入適量裂解液，于冰上裂解30 min;以10 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜;以TBST清洗5 min，以5%脫脂奶粉溶液封閉1 h;加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin一抗、（稀釋度分別為1 ∶ 400、? ? 1 ∶ 500、1 ∶ 500、1 ∶ 500），于4 ℃條件下孵育過夜;以TBST清洗5 min×4次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫振蕩孵育1 h;以TBST 清洗5 min×6次，加入 ECL發(fā)光液，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描。采用Image J v1.44軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值來表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.01），詳見圖1。

3.2 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LDH活性的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LDH活性顯著升高（ P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LDH活性均顯著降低（ P<0.01），詳見圖2。

3.3 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響

正常對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)完整;模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，可見核固縮和核碎片現(xiàn)象;β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核致密濃染、核碎片狀現(xiàn)象明顯減少;β-乳香酸低劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核仍存在致密濃染，核固縮和碎片仍顯著，詳見圖3。

3.4 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率均顯著降低（P<0.05 或 P<0.01），詳見圖4、圖5。

3.5 β-乳香酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（ P<0.01），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（ P<0.01）;與模型組比較，β-乳香酸中、高濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或 P<0.01），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高 （ P<0.05或 P<0.01），詳見圖6、圖7。

4 討論

缺血性腦卒中是危害人類健康的主要疾病之一。發(fā)生缺血性腦卒中后，由于缺氧缺糖導(dǎo)致腦細(xì)胞，尤其是神經(jīng)元細(xì)胞損傷，是造成神經(jīng)功能缺陷的主要原因，因此減少神經(jīng)元細(xì)胞損傷是減輕缺血性腦卒中病情的策略之一[16]。海馬組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動有關(guān)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺氧耐受相對較差的部位[15]。因此，本研究選擇海馬神經(jīng)元細(xì)胞來建立氧糖剝奪損傷模型。

乳香由樹脂、樹膠和揮發(fā)油等組成，其中含量較高的是樹脂（約60%～70%），其主要成分有游離的α-乳香酸、β-乳香酸、11-酮基-β-乳香酸等[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，β-乳香酸在神經(jīng)可塑性中發(fā)揮著核心作用，具有促進(jìn)海馬神經(jīng)元生長和分支的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可顯著升高氧糖剝奪損傷模型海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活率，表明β-乳香酸可通過提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞的存活率，減輕其氧糖剝奪損傷。

LDH廣泛存在于人體各組織內(nèi)，正常細(xì)胞中LDH漏出量很少，而當(dāng)其受損時，細(xì)胞膜的完整性和通透性被破壞，使得LDH漏出[19]。因此，檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中 LDH的活性，即可間接反映細(xì)胞的受損程度。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可降低氧糖剝奪損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中 LDH的活性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核致密濃染、碎片狀現(xiàn)象較模型組明顯減少，細(xì)胞早期凋亡率也顯著降低，說明β-乳香酸可通過減少細(xì)胞凋亡，減輕海馬神經(jīng)元的氧糖剝奪損傷。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，caspase家族、Bcl-2家族等相關(guān)蛋白可參與細(xì)胞凋亡的過程;其中，caspase家族相關(guān)蛋白可參與細(xì)胞凋亡的各個時期[20-21]。該家族由14個成員組成，在正常細(xì)胞中均以無活性的酶原形式存在;其中caspase-3在細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)途徑中位于核心位置，是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的執(zhí)行者，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，初始無活性，當(dāng)收到凋亡信號刺激被激活后，活化為cleaved caspase-3[20]。Bcl-2分布于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，位于線粒體上游，可通過調(diào)節(jié)線粒體膜間隙蛋白的釋放來調(diào)控細(xì)胞凋亡;Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，是Bcl-2家族重要的促凋亡因子[21]。本研究結(jié)果顯示，10、100 μmol/L的β-乳香酸可顯著降低氧糖剝奪損傷模型海馬神經(jīng)元細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平，升高Bcl-2蛋白表達(dá)水平，表明β-乳香酸可通過下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)以及上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷。

綜上所述，β-乳香酸可改善大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-03-28）

（編輯：唐曉蓮）