李月婷 劉亭 吳瓊 陸定艷 王明金 王永林 李勇軍 周孟 劉春花

摘 要 目的：研究葒草花提取物對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的的改善作用及機(jī)制。方法：將H9c2心肌細(xì)胞為正常對(duì)照組、模型組和葒草花提取物低、中、高濃度組（20、40、80 μg/mL），除正常對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞以800 μmol/L CoCl2復(fù)制缺氧復(fù)氧損傷模型，然后觀察細(xì)胞凋亡情況，并分別檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平、鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）、線粒體膜電位（MMP）水平、ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶）活性、細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素c（Cyto c）/線粒體中Cyto c比值、再灌注補(bǔ)救激酶（RISK）信號(hào)通路相關(guān)蛋白[蛋白激酶B（Akt）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）]的磷酸化水平以及缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的蛋白表達(dá)水平。另取細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、葒草花提取物組（80 μg/mL）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002+CoCl2組（15 μmol/L LY294002+800 μmol/L CoCl2）、LY294002+葒草花提取物組（15 μmol/L LY294002+80 μg/mL葒草花提取物）、絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑PD98059+CoCl2組（25 μmol/L PD98059+800 μmol/L CoCl2）、PD98059+葒草花提取物組（25 μmol/L PD98059+80 μg/mL葒草花提取物），同法培養(yǎng)后，測(cè)定細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平，以驗(yàn)證葒草花提取物對(duì)RISK信號(hào)通路的激活作用。結(jié)果：與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細(xì)胞的細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，凋亡小體數(shù)量減少;細(xì)胞中ROS水平、鈣離子水平（低濃度組除外）、MMP、細(xì)胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值和HIF-1α的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;ATP酶活性（低濃度組除外）、Akt蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01）。加入抑制劑LY294002、PD98059后，細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：葒草花提取物可改善H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，其作用機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、提高ATP酶活性、保護(hù)線粒體、調(diào)節(jié)RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 葒草花提取物;H9c2心肌細(xì)胞;缺氧復(fù)氧損傷;補(bǔ)救激酶信號(hào)通路;缺氧誘導(dǎo)因子1α

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and mechanism of Polygonum orientale flower extract on hypoxia- reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes. METHODS： H9c2 cardiomyocytes were divided into normal control group， model group and low-， medium- and high-concentrations groups of P. orientale flower extract （20， 40， 80 μg/mL）. Except for normal control group， other groups were given 800 μmol/L CoCl2 to induce hypoxia-reoxygenation injury model. Cell apoptosis was observed. The levels of Ca2+ （in cytoplasm）， mitochondrial membrane potential （MMP）， ATP enzyme （Na+-K+-ATP enzyme， Ca2+-Mg2+-ATP enzyme） activities， the ratio of cytochrome c（Cyto c）? ?protein in cytosol to mitochondria， phosphorylation levels of reperfusion injury salvage kinase （RISK） signaling pathway related protein [protein kinase B （Akt） and extracellular signal regulated kinase 1/2 （ERK1/2）] as well as protein expression of HIF-1α were detected respectively. In addition， the cells were divided into normal control group， model group and P. orientale flower extract group （80 μg/mL）， PI3K inhibitor LY294002+CoCl2 group （15 μmol/L LY294002+80 μmol/L CoCl2），? LY294002+P. orientale flower extract group （15 μmol/L LY294002+80 μg/mL P. orientale flower extract）， MEK inhibitor PD98059+CoCl2 group （25 μmol/L PD98059+800 μmol/L CoCl2）， PD98059+P. orientale flower extract group （25 μmol/L PD98059+80 μg/mL P. orientale flower extract）. After cultured by the same method， the phosphorylation levels of Akt protein and ERK1/2 protein in the cells were measured to verify the activation of P. orientale flower extract to RISK signaling pathway. RESULTS： Compared with model group， nuclear pyknosis and the number of apoptotic bodies were reduced in different concentrations groups of P. orientale flower extract. ROS level， Ca2+ level （except for low-concentration group）， MMP， ratio of Cyto c in cytoplasm to Cyto c in mitochondria， protein expression of HIF-1α were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the activity of ATP enzyme （except for the low-concentration group）， Akt protein and ERK1/2 protein phosphorylation level were significantly increased （P<0.01）. After treated with PI3K inhibitor LY294002 and MEK inhibitor PD98059， Akt protein and ERK1/2 protein phosphorylation level in cadiomyocyte were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： P. orientale flower extract can improve hypoxia-reoxygenation injury of H9c2 cardiomyocytes， the mechanism of which may be associated with inhibiting cardiomyocyte apoptosis， improving ATPase activity， protecting mitochondria， regulating RISK signaling pathway related proteins and HIF-1α protein expression.

KEYWORDS? ?Polygonum orientale flower extract; H9c2 cardiomyocytes; Hypoxia-reoxygenation injury; RISK signaling pathway; HIF-1α

葒草為蓼科植物葒草Polygonum orientale L.的干燥果穗及帶葉莖枝，其味辛，性涼，有小毒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血消腫的功效，常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、心胃氣痛、疝氣、腳氣、瘡腫[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葒草的花序（即葒草花）具有明顯的抗心肌缺血、抗氧化損傷的作用[2-5]，且對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的過(guò)氧化氫損傷和缺氧復(fù)氧損傷具有明顯的改善作用[3-4]。但是，葒草花抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用機(jī)制尚不明確。

線粒體在參加和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的損傷方面發(fā)揮著重要作用[6]。嚴(yán)重的缺氧環(huán)境會(huì)損傷線粒體的電子傳遞鏈[7]，從而損傷線粒體，因此在復(fù)氧過(guò)程中，由于受損線粒體的驅(qū)動(dòng)，使得大量活性氧（ROS）產(chǎn)生、鈣離子失調(diào)，進(jìn)而改變線粒體的通透性，導(dǎo)致線粒體腫脹和損傷[6，8];另外，受損的線粒體還可導(dǎo)致線粒體的功能失調(diào)，從而釋放細(xì)胞色素 c（Cyto c）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)[9]，進(jìn)而激活線粒體的重構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞存亡的反應(yīng)[6]，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死。因此，保護(hù)線粒體是治療心肌細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)。

Hausenloy等[10]提出了再灌注損傷補(bǔ)救激酶（RISK）的概念，且相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)RISK信號(hào)通路在心肌缺血/再灌注損傷中具有關(guān)鍵作用[11]。RISK由磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）這兩條信號(hào)通路組成，當(dāng)RISK被激活時(shí)，可顯著減少心肌梗死面積，因而是眾多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及藥物干預(yù)的靶點(diǎn)[11-13]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是缺氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞耐受缺氧環(huán)境和維持氧平衡具有重要作用，且與心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[14]。

基于此，本研究采用氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，然后檢測(cè)葒草花提取物對(duì)其細(xì)胞中ROS水平、鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）、線粒體膜電位（MMP）、腺苷三磷酸（ATP）酶活性、Cyto c蛋白表達(dá)（細(xì)胞質(zhì)和線粒體中）、RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白及HIF-1α蛋白表達(dá)等的影響，并應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002（簡(jiǎn)稱“LY”）和絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制劑PD98059（簡(jiǎn)稱“PD”）[15-16]，驗(yàn)證葒草花提取物對(duì)RISK信號(hào)通路的激活作用，從而探討葒草花改善H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Forma 321 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），Model 680型酶標(biāo)儀、Trans-Blot Turbo蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Power Pac Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Allegra 64R型冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），GBOX chemi XL1.4型凝膠成像儀（英國(guó)Sysgene公司），R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

葒草花藥材采收于貴州省貴陽(yáng)市鹿沖關(guān)植物園，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥民族藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定為蓼科植物葒草P. orientale的干燥花序。其他藥品與試劑有：BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)PC0020-500），磷酸鹽緩沖液（PBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為10010049、12430047、R001100、12664025），抑制劑LY、抑制劑PD、CoCl2、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)9908、P215、255599、D2447），ROS檢測(cè)試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342染液、Fluo-4 AM鈣離子熒光探針、BSA蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為S0033S、C2006、C1026、S1060、ST025），ATP酶試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)V7001），細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒（中國(guó)Sangon Biotech公司，批號(hào)C500051-0050），小鼠源β-actin單克隆抗體、兔源Cyto c單克隆抗體、兔源Akt多克隆抗體、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體、兔源ERK單克隆抗體、兔源磷酸化ERK（p-ERK）多克隆抗體、兔源HIF-1α單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab8226、ab133504、ab38449、ab8805、ab184699、ab217322、ab179483、ab6721、ab6728），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)IPVH00010）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

本研究所用細(xì)胞為大鼠H9c2心肌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 葒草花提取物的制備

參照本課題組前期研究方法[17]，取葒草花藥材7.0 kg，經(jīng)水提、醇沉后，以水飽和正丁醇溶液萃取，收集正丁醇層，減壓干燥;殘?jiān)?0%乙醇溶解，然后上聚酰胺柱，以80%乙醇進(jìn)行洗脫;收集洗脫液，減壓回收乙醇，殘留物采用微波真空干燥器進(jìn)行干燥，即得葒草花提取物（得率為3.43%）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9c2心肌細(xì)胞接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（下同），待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 分組、造模與給藥

參考文獻(xiàn)[3]方法復(fù)制缺氧復(fù)氧損傷模型。將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上清液;將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組和葒草花提取物低、中、高濃度組（20、40、80 μg/mL，以提取物計(jì)，藥物質(zhì)量濃度根據(jù)課題組前期研究設(shè)置[3-4]）。模型組細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為800? ? ? ?μmol/L的CoCl2溶液（臨用時(shí)以完全培養(yǎng)基溶解制成），培養(yǎng)22 h以刺激細(xì)胞，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h;葒草花提取物低、中、高濃度組細(xì)胞分別加入終濃度分別為20、40、80 μg/mL的葒草花提取物溶液（臨用時(shí)以完全培養(yǎng)基溶解制成）100 μL，培養(yǎng)24 h后，按上述“加入終濃度為800 μmol/L的CoCl2溶液……換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h”方法操作;正常對(duì)照組細(xì)胞以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與方法同模型組，但不進(jìn)行造模。

2.4 H9c2心肌細(xì)胞凋亡的觀察

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基;以PBS洗滌2次，每孔加入1×Hoechst 33342染色液1 mL，培養(yǎng)20 min;棄去含染料的培養(yǎng)基，以無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后，采用熒光顯微鏡觀察并拍照（正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成均勻的藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈碎裂、濃縮的明亮藍(lán)色）。

2.5 H9c2心肌細(xì)胞中ROS水平的檢測(cè)

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基;按ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法操作后，采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其綠色熒光強(qiáng)度，以評(píng)價(jià)細(xì)胞中ROS水平（綠色熒光強(qiáng)度越大，則表示細(xì)胞中ROS水平越高）。

2.6 H9c2心肌細(xì)胞中鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）的檢測(cè)

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌3次;按Fluo-4 AM鈣離子熒光探針檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法操作后，采用熒光顯微鏡觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析其綠色熒光強(qiáng)度，以評(píng)價(jià)細(xì)胞質(zhì)中鈣離子水平（綠色熒光強(qiáng)度越大，則表示細(xì)胞質(zhì)中鈣離子水平越高）。

2.7 H9c2心肌細(xì)胞MMP的檢測(cè)

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌1次;按JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法操作后，采用熒光顯微鏡觀察并拍照，并隨機(jī)選取5個(gè)不同視野拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析綠色和紅色熒光強(qiáng)度，并以綠色與紅色熒光強(qiáng)度的比值評(píng)價(jià)MMP（比值越大，則表示細(xì)胞MMP越高）。

2.8 H9c2心肌細(xì)胞中ATP酶活性的測(cè)定

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，以胰蛋白酶消化;收集細(xì)胞至10 mL離心管中，以1 500 r/min離心3 min，棄上清液，沉淀以PBS洗滌2次;加入生理鹽水5 mL，于冰浴條件下，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞（功率為300 W，頻率為40 kHz，每隔4 s超聲1次）;經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取適量蛋白，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書方法操作，測(cè)定細(xì)胞中ATP酶（包括Na+-K+ -ATP酶和Ca2+-Mg2+- ATP酶）的活性。

2.9 H9c2心肌細(xì)胞中Cyto c蛋白、RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白及HIF-1α蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，以PBS洗滌2次;加入胰酶1 mL消化2 min后，加入完全培養(yǎng)基終止消化;以1 000 r/min離心3 min，棄上清液，收集沉淀，按照細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明書方法操作，提取細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的蛋白，備用。另外，按上述方法對(duì)H9c2心肌細(xì)胞分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）、造模和給藥處理后，以預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液（含1% PMSF）冰浴裂解細(xì)胞5 min，于4 ℃以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液，得細(xì)胞總蛋白，備用。取線粒體蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、總蛋白適量，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度;蛋白經(jīng)變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加入5%BSA溶液封閉2 h，然后分別加入Cyto c、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、HIF-1α、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），室溫孵育2 h;以TBST洗滌5 min×5次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度均為1 ∶ 8 000），室溫孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜5 min×5次后，加入ECL顯色，并于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。采用Quantity One 4.6軟件進(jìn)行分析，以Cyto c在細(xì)胞質(zhì)中灰度值與在線粒體中灰度值的比值表示線粒體膜的開放程度（比值越大，則表示線粒體膜開放程度越大）;以p-Akt與Akt、p-ERK1/2與ERK1/2的灰度值的比值分別表示Akt、ERK1/2的磷酸化水平;以HIF-1α與內(nèi)參β-? ?actin的灰度值的比值表示其表達(dá)水平。

2.10 加入抑制劑后H9c2心肌細(xì)胞中RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

將H9c2心肌細(xì)胞以5×104 mL-1的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，然后分為正常對(duì)照組、模型組、葒草花提取物組（80 μg/mL，濃度根據(jù)前期研究設(shè)置）、LY+? ?CoCl2組（15 μmol/L LY+800 μmol/L CoCl2）、LY+葒草花提取物組（15 μmol/L LY+80 μg/mL葒草花提取物）、PD+CoCl2組（25 μmol/L PD+800 μmol/L CoCl2）、PD+葒草花提取物組（25 μmol/L PD+80 μg/mL葒草花提取物），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。其中，LY和PD給藥濃度根據(jù)文獻(xiàn)[18-20]設(shè)置。除正常對(duì)照組、模型組、葒草花提取物組外，其余各組細(xì)胞均在造模前加入相應(yīng)抑制劑預(yù)處理20 min，然后再按“2.3”項(xiàng)下方法造模與給藥。分組培養(yǎng)完畢后，按“2.9”項(xiàng)下方法提取細(xì)胞總蛋白并檢測(cè)加入抑制劑后RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常、核染色均勻;模型組細(xì)胞核固縮、致密濃染，可見大量凋亡小體;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，凋亡小體數(shù)量減少，詳見圖1。

3.2 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中ROS水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ROS水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細(xì)胞中ROS水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表1。

3.3 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物中、高濃度組細(xì)胞中鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表1。

3.4 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞MMP水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細(xì)胞MMP水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表1。

3.5 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中ATP酶活性的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物中、高濃度組細(xì)胞中上述酶活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.6 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中Cyto c蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花水提物各濃度組細(xì)胞中上述指標(biāo)比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表3。

3.7 葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.01），HIF- 1α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物各濃度組細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），詳見圖6、表3。

3.8 加入抑制劑后葒草花提取物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，葒草花提取物組細(xì)胞中Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與葒草花提取物組比較，LY+葒草花提取物組細(xì)胞中Akt蛋白磷酸化水平和PD+葒草花提取物組細(xì)胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖7、表4。

4 討論

CoCl2是一種模擬缺氧條件的化學(xué)試劑，常被用來(lái)制備細(xì)胞缺血缺氧損傷模型[21]。在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上[3]，本研究采用800 μmol/L CoCl2復(fù)制H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型。在體內(nèi)外的細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和鈣離子誘導(dǎo)的線粒體功能障礙驅(qū)動(dòng)了細(xì)胞的損傷和凋亡[21-23]，其中ROS是氧化應(yīng)激中破壞機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的主要根源[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、致密濃染，可見大量凋亡小體;細(xì)胞中ROS水平顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，細(xì)胞中ROS水平顯著降低。這表明葒草花提取物可通過(guò)提高細(xì)胞清除ROS的能力，從而發(fā)揮抗缺氧復(fù)氧損傷的作用。

ATP酶是存在于生物膜上的一種蛋白酶，具有物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等生物學(xué)功能;機(jī)體在缺氧刺激下，心肌細(xì)胞會(huì)迅速由有氧代謝轉(zhuǎn)為無(wú)氧糖酵解，使細(xì)胞中ATP耗竭，進(jìn)一步引起一系列的代謝紊亂和異常，從而使得依靠ATP轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)ATP酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子交換出現(xiàn)異常，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶活性顯著降低，鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，上述ATP酶活性顯著升高，鈣離子水平（細(xì)胞質(zhì)中）顯著降低。這表明葒草花提取物可通過(guò)提高ATP酶活性，維持心肌細(xì)胞中正常的物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等生物學(xué)功能，從而逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞中鈣離子水平的升高，最終發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的打開會(huì)導(dǎo)致膜電位去極化、釋放凋亡因子和降低氧化磷酸化水平[26]，因此測(cè)定MMP可評(píng)價(jià)線粒體的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細(xì)胞MMP顯著升高，經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，細(xì)胞MMP顯著降低，這表明葒草花提取物可通過(guò)保護(hù)線粒體，改善H9c2心肌細(xì)胞的缺血缺氧損傷。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線粒體的功能失調(diào)時(shí)，可釋放Cyto c進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)[9]，進(jìn)而激活線粒體的重構(gòu)[6]，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧損傷H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Cyto c/線粒體中Cyto c比值顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，上述指標(biāo)比值顯著降低。這表明葒草花提取物可通過(guò)降低缺血缺氧損傷H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜的開放程度，改善其缺氧復(fù)氧損傷。

RISK信號(hào)通路是機(jī)體對(duì)抗心肌缺血再灌注的最重要的通路之一[27]。當(dāng)心肌細(xì)胞受到缺氧復(fù)氧刺激時(shí)，多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)會(huì)依賴于RISK途徑發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中Akt蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平均顯著升高;使用Akt蛋白和ERK蛋白的抑制劑分別處理后，細(xì)胞中Akt蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平均顯著降低，說(shuō)明葒草花提取物對(duì)Akt蛋白和ERK蛋白的激活作用被阻斷，證實(shí)了其可能是通過(guò)RISK信號(hào)通路對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

當(dāng)HIF-1α在機(jī)體常氧條件下保持穩(wěn)定水平時(shí)，具有保護(hù)心肌缺血再灌注的作用，但是，當(dāng)其過(guò)度表達(dá)時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致心臟損傷[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)水平顯著升高;經(jīng)葒草花提取物干預(yù)后，細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低。這表明葒草花提取物可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，葒草花提取物可改善H9c2心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，其作用機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、提高ATP酶活性、保護(hù)線粒體、調(diào)節(jié)RISK信號(hào)通路相關(guān)蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2021-01-29 修回日期：2021-03-12）

（編輯：唐曉蓮）