張燕梅 李俊峰 楊子平 鹿志偉 陸軍迎 周文釗

摘 ?要：本研究基于劍麻轉(zhuǎn)錄組測序獲得的70 110條Unigene序列，采用MISA 1.0軟件查找SSR位點(diǎn)，利用Primer 3.0設(shè)計(jì)SSR引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)其中的100對(duì)SSR引物有效性進(jìn)行驗(yàn)證?？傆?jì)獲得了13 175個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的分布頻率為15.61%。70 110條Unigene序列總計(jì)包括60種重復(fù)基元，其中單核苷酸重復(fù)為主導(dǎo)重復(fù)類型（37.96%），其次是二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，比例分別為32.92%和27.90%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)所占比例總計(jì)為1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分別為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基元。100對(duì)SSR引物中有68對(duì)引物可擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，其中18對(duì)引物在6份劍麻種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性，該結(jié)果為利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開展劍麻種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：劍麻;轉(zhuǎn)錄組測序;SSR

中圖分類號(hào)：S563.8 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In this study， the high-throughput sequencing of the transcriptome of sisal was used to seek SSR loci and de-velop SSR markers by MISA 1.0 and Primer 3.0 softwares， respectively， and preliminary primer verification and poly-morphic primer analysis were performed by vertical acrylamide gels. A total of 13 175 of SSR loci were found in the 70 110 unigene sequences. The SSR distribution frequency was 15.61%. In total， 60 repeat elements were obtained， among them， mono- nucleotides were the domiant repeat motif （37.96%）， followed by di-nucleotides （32.92%）， and tri-nucleotides repeats （27.90%）， the other repeat types occupied 1.21% in all. The most dominant mono-nucleotide， di-nucleotide and tri-nucleotide repeat motif was A/T， AG/CT and AAG/TTC， respectively. Among the 100 pairs of SSR primers randomly selected from the designed SSR primers of Rema No. 1， sixty-eight pairs of primers could amplify the expected size bands， and eighteen primers showed polymorphism among six sisal germplasms. The obtained primers would provide effective molecule markers for genetic diversity analysis and germplasm identification of sisal.

Keywords： sisal; RNA-seq; simple sequence repeats

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.009

劍麻是一種重要的熱帶纖維作物，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于劍麻自然條件下變異頻發(fā)且倍性復(fù)雜[1]，現(xiàn)有保存的種質(zhì)資源中，主要是通過麻園選育、雜交和引種獲得，遺傳背景模糊，命名極不規(guī)范，有的很難從表型加以辨別，給劍麻種質(zhì)資源的保存利用以及育種工作帶來極大不便。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)給遺傳育種研究注入了新的活力，并且在劍麻品種鑒定以及遺傳多樣性分析等方面得到廣泛的應(yīng)用[2-8]。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）又稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），是由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)而成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，按其來源可分為基因組SSR（gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，可以區(qū)分純合子和雜合子，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[9]、種質(zhì)資源鑒定[10]以及遺傳作圖[11]等領(lǐng)域。目前劍麻中報(bào)道的SSR引物僅有7對(duì)，由于劍麻SSR引物偏少，獲得的信息量有限，因此，開發(fā)劍麻SSR標(biāo)記引物對(duì)開展劍麻遺傳研究十分必要。劍麻基因組較大（1Cx≈7.5 pg）[1]，基因組信息未知，在短時(shí)間內(nèi)開發(fā)gSSR標(biāo)記幾乎不可能，隨著生物信息學(xué)和測序技術(shù)的飛速發(fā)展，EST序列數(shù)據(jù)劇增，利用EST序列開發(fā)SSR標(biāo)記引物成為可能，并且在其他物種中已有成功的報(bào)道[12]。鑒于此，本研究基于前期獲得的劍麻轉(zhuǎn)錄組序列，利用MISA軟件查找SSR位點(diǎn)，開發(fā)劍麻SSR標(biāo)記引物，解決劍麻SSR標(biāo)記引物缺乏等實(shí)際問題，同時(shí)為劍麻遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 ?劍麻轉(zhuǎn)錄組序列主要來源于本課題前期獲得的‘熱麻1號(hào)的70 110個(gè)Unigenes序列。

1.1.2 ?植物材料 ?植物材料為一年生的‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號(hào)‘無刺番麻和普通劍麻走莖苗。每份材料取3～5株，每株取1 g葉片等量混合后用于提取基因組DNA。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?DNA提取采用天澤公司的柱式植物DNAout試劑盒提取，實(shí)驗(yàn)材料用液氮快速研磨后取少量粉末，加入裂解液，經(jīng)抽提、漂洗后過柱，洗脫后4 ℃保存?zhèn)溆?，具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.2 ?SSR位點(diǎn)查找 ?采用MISA 1.0軟件對(duì)每個(gè)Unigene進(jìn)行簡單序列重復(fù)（SSR）位點(diǎn)查找，SSR位點(diǎn)篩選參數(shù)為：單核苷酸的重復(fù)次數(shù)大于或等于10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)大于或等于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復(fù)次數(shù)大于或等于5次。

1.2.3 ?SSR引物開發(fā) ?采用Primer Premier 3.0設(shè)計(jì)引物，引物長度18～25 bp，GC含量為40%～ 60%，退火溫度Tm為56～65 ℃，預(yù)期產(chǎn)物長度為100～300 bp，盡量避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 ?SSR引物有效性驗(yàn)證 ?隨機(jī)選取100對(duì)SSR引物，以‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號(hào)‘無刺番麻和普通劍麻等6份種質(zhì)的基因組DNA混合池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，150 V，2.5 h后取下膠板，銀染后拍照保存。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋菏紫?4 ℃（15 s），60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，16個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃;然后進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增階段：94 ℃ 15 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，15個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸60 min，擴(kuò)增產(chǎn)物加入1/3體積的上樣緩沖液，混勻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ?SSR引物多態(tài)性篩選 ?分別以‘H.11648‘肯1‘肯2‘熱麻1號(hào)‘無刺番麻和普通劍麻等6份種質(zhì)的基因組DNA為模板，對(duì)檢測有目標(biāo)產(chǎn)物條帶的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染后拍照保存。擴(kuò)增程序和檢測方法同SSR引物有效性驗(yàn)證。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?劍麻SSR位點(diǎn)的分布與數(shù)量

‘熱麻1號(hào)的70 110條Unigenes序列全長總計(jì)45 255 938 bp，經(jīng)MISA分析后發(fā)現(xiàn)有10 946條Unigenes序列共含有13 175個(gè)SSR位點(diǎn)（1/3.43），SSR發(fā)生頻率（含SSR的Unigene數(shù)/總Unigene數(shù)）為15.61%，SSR出現(xiàn)頻率（SSR位點(diǎn)數(shù)/總Unigene數(shù)）為18.79%，其中有1 848條序列含有2個(gè)或2個(gè)以上的SSR位點(diǎn)，803個(gè)SSR位點(diǎn)以復(fù)合形式存在?！疅崧?號(hào)‘轉(zhuǎn)錄組SSR類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)均存在，其中單核苷酸為主導(dǎo)重復(fù)基元，比例為37.96%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，比例分別為32.92%和27.90%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸比例較低，分別為1.03%、0.12%和0.06%。從基元重復(fù)次數(shù)來看（表1），‘熱麻1號(hào)轉(zhuǎn)錄組SSR單核苷酸重復(fù)中10～12次重復(fù)較多，占單核苷酸SSR的66.63%，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)中5～9次重復(fù)較多，分別占二核苷酸的84.95%，三至六核苷酸的100%。

2.2 ?劍麻SSR基序頻率特征及重復(fù)類型

‘熱麻1號(hào)的13 175個(gè)SSR位點(diǎn)，共包含60種重復(fù)基元，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)基元數(shù)分別為2、4、10、23、13和8種。單核苷酸重復(fù)基元主要有A/T和C/G兩種類型，其中A/T類型4936個(gè)，占單核苷酸重復(fù)的98.70%。二核苷酸有AG/CT、AC/GT、AT/AT、CG/CG等4種重復(fù)類型，其中AG/CT最多，占二核苷酸重復(fù)類型的86.01%，CG/CG比例最低，為1.06%（圖1）。三核苷酸有10種重復(fù)類型，其中AAG/CTT、AGG/CCT、AGC/TCG、CCG/CGG所占比例較高，分別為21.68%、21.41%、14.99%、12.68%，ACT/AGT比例最低，為0.46%（圖1）。四核苷酸有23種重復(fù)類型，除AAAG（22.22%）、AAAT（19.26%）、AAAC（9.63%）、ACAT（8.89%）和AGCG（7.41%）外，其他每種類型數(shù)量均在1～5之間，出現(xiàn)頻率較低。五核苷酸和六核苷酸分別有13和8種重復(fù)類型，每種重復(fù)類型數(shù)量均為1。

2.3 ?SSR引物有效性驗(yàn)證

利用6份劍麻種質(zhì)基因組DNA混合池為模板，隨機(jī)選取100對(duì)SSR引物進(jìn)行檢測分析，有68對(duì)引物可擴(kuò)增出穩(wěn)定的目標(biāo)產(chǎn)物條帶，表明開發(fā)的SSR引物有效，且引物擴(kuò)增效率為68%（圖2，表2）。

2.4 ?多態(tài)性SSR引物篩選

分別以6份劍麻種質(zhì)基因組DNA為模板，對(duì)68對(duì)有目標(biāo)產(chǎn)物條帶的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后篩選出18對(duì)有多態(tài)性的SSR引物，多態(tài)性比率為26.47%（圖3），多態(tài)性引物及其DNA序列見表3。

3 ?討論

劍麻作為熱區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物和景天酸代謝的模式物種，有非常重要的經(jīng)濟(jì)和理論價(jià)值[13]。然而由于劍麻遺傳背景復(fù)雜，基因組信息缺乏，使?劍麻的遺傳改良研究相對(duì)滯后。本研究從‘熱麻1號(hào)的70 110條Unigene序列中搜索到13 175個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于10 946條Unigene序列上，SSR出現(xiàn)頻率為18.79%，SSR發(fā)生頻率為15.61%，平均距離為3.43 kb。與其他植物相比，劍麻的出現(xiàn)頻率與水牛草（14.41%）[12]和不結(jié)球白菜（18.44%）[14]相當(dāng)，高于小麥（7.41%）[15]，甜葉菊（2.26%）[16]和紅松（7.43%）[17]，白芷（13.18%）[18]等，但明顯低于芒果[19]，枇杷（22.02%）[20]和橡膠樹（35.58%）[21]，不同物種間SSR出現(xiàn)頻率不同主要與SSR搜索時(shí)使用的軟件工具，重復(fù)類型以及最小重復(fù)數(shù)，長度標(biāo)準(zhǔn)以及分析數(shù)據(jù)量的大小不同有關(guān)[22-23]。

本研究結(jié)果表明，劍麻轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸SSR數(shù)量最多（37.96%），與紅松[17]和太行菊[24]等植物中報(bào)道的相似，與竹子[25]、老芒麥[26]、水牛草[12]以及水稻、小麥等單子葉植物[27]不同。除單核苷酸外，劍麻中二核苷酸SSR數(shù)量較多（32.93%），二核苷酸優(yōu)勢重復(fù)基元為AG/CT，這與天麻[28]、小麥[27]、老芒麥[26]等大多數(shù)單子葉植物相同，Kumpatla等[23]對(duì)49種雙子葉植物SSR分析表明，二核苷酸重復(fù)為主導(dǎo)重復(fù)類型，其次為三核苷酸重復(fù)或單核苷酸重復(fù)，重復(fù)類型非冗余EST序列包含SSR數(shù)量排名前20的SSR重復(fù)基元進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，AG/GA/CT/TC為20種雙子葉植物樣本中的二核苷酸優(yōu)勢重復(fù)基元，AAG/AGA/GAA/ CTT/TTC/TCT為三核苷酸優(yōu)勢基元，這與本研究結(jié)果相似，Morgante等[27]和Varshney等[29]研究證實(shí)植物eSSR中AG/CT為二核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢重復(fù)基元，這與本研究結(jié)果非常吻合，但本研究中CG重復(fù)比例較低，而Morgante等[27]研究顯示AT重復(fù)比例較低。劍麻中三核苷酸比例次于單核苷酸和二核苷酸，以AAG/TTC、AGG/CCT為優(yōu)勢基元。這與Morgante等[27]報(bào)道的在水稻、小麥、玉米等單子葉植物中三核苷酸比例最高且CCG為優(yōu)勢基元結(jié)果不同，這種現(xiàn)象在多種植物中均有報(bào)道[23]。Kumpatla等[23]分析認(rèn)為，不同物種間以及同一物種內(nèi)主導(dǎo)核苷酸重復(fù)類型以及優(yōu)勢基元不同，主要原因可能與SSR分析過程中采用的搜索工具、分析時(shí)設(shè)置的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以及分析時(shí)數(shù)據(jù)量的大小等有關(guān)。此外，3UTR富含三核苷酸和四核苷酸，5UTR富含二核苷酸和三核苷酸，EST序列中3UTR和5UTR的比例對(duì)核苷酸重復(fù)類型也存在影響。

綜上所述，本研究利用現(xiàn)有的劍麻EST-SSR序列開發(fā)SSR標(biāo)記引物是可行且有效的，并且本研究結(jié)果是對(duì)劍麻SSR引物的一個(gè)很好補(bǔ)充，利用篩選的18對(duì)SSR引物可以開展劍麻種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析以及親本鑒定研究，若要開展劍麻遺傳圖譜構(gòu)建和比較作圖等，還需要篩選更多的SSR引物。

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責(zé)任編輯：黃東杰