辛明 李昌寶 孫宇 盛金鳳 唐雅園 孫健 李杰民 李麗 何雪梅 零東寧

摘 ?要：為闡明采后百香果香氣品質(zhì)的變化特征，本研究采用頂空-固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），研究了常溫（25 ℃）、低溫（6 ℃）貯藏期間百香果香氣物質(zhì)主要成分及其含量，酯類化合物代謝關(guān)鍵酶脂氧合酶（LOX）、醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）、乙醇脫氫酶（ADH）和氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明：百香果在常溫和低溫貯藏期間，果汁中的香氣物質(zhì)均以酯類為主，相對(duì)含量分別占總香氣物質(zhì)的40.00%～60.32%和54.95%～69.27%，其次是醇類和酮類;進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)鑒定，在酯類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物為丁酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸己酯、乙酸乙酯、己酸己酯;常溫下，百香果酯類物質(zhì)相對(duì)含量在貯藏4 d時(shí)出現(xiàn)峰值（60.32%）、貯藏12 d時(shí)下降為40.00%，而低溫下，其相對(duì)含量延至貯藏20 d時(shí)出現(xiàn)峰值（69.27%），整個(gè)貯藏期內(nèi)保持在54.62%～69.27%，表明低溫貯藏可以維持酯類物質(zhì)較高的相對(duì)含量。對(duì)百香果酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性分析發(fā)現(xiàn)，果汁中LOX、AAT和HPL在低溫貯藏前期（0～10 d）活性變化不大，貯藏后期表現(xiàn)活躍，最高值出現(xiàn)時(shí)間遲于常溫貯藏，表明低溫可以有效抑制酯類代謝關(guān)鍵酶活性;另外，酯類香氣化合物相對(duì)含量與LOX、AAT、ADH、HPL活性具有較強(qiáng)相關(guān)性。本研究為百香果采后品質(zhì)保持和保鮮技術(shù)提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百香果;香氣成分;酯類;酶活性;相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)：TS255.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To clarify the variation characteristics of aroma quality in postharvest passion fruit， headspace-solid phase microextraction （HS-SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to determinethe main components and the contents in the fruit volatiles during storage at ambient temperature （25 ℃） and low tem-perature （6 ℃）. The present study further analyzed the activity variation rule of key enzymes in ester metabolism pathway， such as lipoxygenase （LOX）， alcohol acyltransferase （AAT）， alcohol dehydrogenase （ADH） and hydroperoxide lyase （HPL）. The results showed that the main aroma components in passion fruit juice were esters during storage at ambient and low temperatures， and their relative contents accounted for 40.00%-60.32% and 54.95%-69.27%， followed by alcohols and ketones. Furthermore， the main ester components with high relative contents were identified as ethyl butanoate， ethyl n-hexanoate， hexyl butyrate， ethyl acetate and hexyl hexanoate. During storage at ambient temperature， the relative content of esters in passion fruit peaked on 4th day （60.32%） and decreased to 40.00% on 12th day. However， this relative content peak appeared on 20th day （69.27%） and remained 54.62%-69.27% within the whole storage period at low temperature. Above results indicated that high relative content of esters could be maintained by low temperature storage. The analyses on key enzymatic activities in ester metabolism pathway showed that little variation of LOX， AAT and HPL activities appeared in passion fruit juice during early storage period （0-10 d） at low temperature. The enzymes were active during late storage period. The activity peaks appeared later than those at ambient temperature storage， indicating that low temperature could effectively inhibit the activities of key enzymes in ester metabolism pathway. In addition， the relative contents of ester components were strongly correlated with the activities of LOX， AAT， ADH and HPL. This study would provide reference for quality maintenance and postharvest preservation of passion fruit.

Keywords： passion fruit （Passiflora caerulea L.）; aroma components; esters; enzyme activity; correlation analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.037

百香果為西番蓮科（Passiflora caerulea L.）西番蓮屬（Passiflora）多年生常綠藤本植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)特有水果[1-2]。我國(guó)主要分布在廣西、福建、海南、廣東、云南、臺(tái)灣等地[3]，其中，廣西、福建百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，2017年兩省栽培面積分別達(dá)14 000、6 700 hm2[4-5]。百香果香氣成分豐富，因含有草莓、芒果、蘋果、番石榴、香蕉、菠蘿等多種水果的香氣而得名，有“果汁之王”和“香料水果”之美譽(yù)[6]。濃郁怡人的香氣是百香果風(fēng)靡市場(chǎng)、備受消費(fèi)者青睞的重要因素之一。

百香果香氣的特殊性引起越來(lái)越多研究者的興趣。Macoris等[7]在百香果果肉中分離檢測(cè)到77種化合物，其中以丁酸甲酯、乙酸丁酯、己醛、丁酸丁酯、反式-3-己烯乙酸酯、順式-3-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯等酯類為主要揮發(fā)性化合物。Porto-Figueira等[8]發(fā)現(xiàn)酯類為9種百香果鮮果揮發(fā)性物質(zhì)中最主要成分，品種間揮發(fā)性化合物圖譜存在差異。Janzantti等[9]采用動(dòng)態(tài)頂空套袋采樣技術(shù)對(duì)百香果鮮果汁進(jìn)行前處理，共分離鑒定出64種揮發(fā)性香氣化合物。潘葳等[10]鑒定出5個(gè)品種百香果鮮果汁中共含有68種香氣成分，其中酯類含量最高，其次為醇類、酮類、萜烯類、烷類、醚類和雜環(huán)類。近年來(lái)關(guān)于水果香氣代謝途徑的研究主要集中在酶與果實(shí)香氣物質(zhì)形成關(guān)系上，百香果主要香氣成分為酯類化合物（66.68%～91.92%）[10-11]，酯類代謝途徑中的關(guān)鍵酶脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，AAT）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、氫過(guò)氧化物裂解酶（hydroperoxide lyse，HPL）等已成為研究熱點(diǎn)[12-14]。LOX是脂肪酸代謝途徑初始過(guò)程中重要的限速酶，可將脂肪酸轉(zhuǎn)化為氫過(guò)氧化物，參與以脂肪酸為前體的直鏈酯的合成，催化亞油酸、亞麻酸產(chǎn)生C6、C9化合物[15]。AAT是參與酯類香氣合成途徑中的最終限速酶，它可以催化醇類底物與?；o酶A酯化為相應(yīng)的酯類物質(zhì)，從而生成果實(shí)酯類香氣成分中的特征香氣[16]。ADH是醇類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，存在于醛和醇之間的內(nèi)在轉(zhuǎn)換中，使醛先轉(zhuǎn)化為酸或醇后才能再轉(zhuǎn)化為酯類化合物，其為酯類化合物的合成提供前體[17]。HPL是脂肪氧化途徑中LOX下游的酶，以LOX的氧化產(chǎn)物為底物，脂氫過(guò)氧化物在HPL的催化作用下發(fā)生裂解反應(yīng)生成短鏈醛和含氧酸[18]。

前人多以百香果鮮果為對(duì)象開展香氣成分研究，但在不同貯藏條件下，百香果香氣物質(zhì)種類組成與含量都會(huì)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生很大變化。截至目前，針對(duì)百香果采后貯藏過(guò)程中香氣成分及其相關(guān)酶的變化特征鮮有報(bào)道。百香果采后貯藏期間香氣成分變化不但是衡量其貨架壽命的重要指標(biāo)之一，也是評(píng)價(jià)百香果產(chǎn)品品質(zhì)差異與市場(chǎng)定價(jià)的一個(gè)重要因素。本文采用頂空-固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析百香果果汁香氣物質(zhì)及其代謝關(guān)鍵酶活性，以期揭示貯藏過(guò)程中香氣品質(zhì)的變化規(guī)律，為百香果采后保鮮與品質(zhì)保持技術(shù)開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?百香果（Passiflora caerulea L.）品種為‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)，2018年10月采自廣西南寧市邕寧區(qū)，選7～8成熟（花后55～60 d）果實(shí)，采收后立刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

乙酸、乙酸鈉、硼酸、鹽酸、氯化鎂、丁醇、碳酸氫鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、二硫蘇糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、甘油、苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑（PMSF）、山梨醇、三羥甲基氨基甲燒（Tris），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;5，5-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、還原型輔酶（NADH）、二硫蘇糖醇（DTT）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），上海源葉生物有限公司;亞油酸鈉、乙酰輔酶A，酷爾化學(xué)科技有限公司。上述試劑均為分析純。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?SPME裝置手柄、固定搭載裝置、雙極性50/30 ?m二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydi- methylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭，美國(guó)Supelco公司;Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司;D-37520型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賽默飛世爾有限公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;離子PTP-IV-30型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，廣州品業(yè)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料預(yù)處理及取樣 ?挑選無(wú)機(jī)械傷、果形端正、無(wú)病蟲斑、大小及成熟度一致的果實(shí)。用濃度為500 mg/L的次氯酸鈉溶液浸泡果實(shí)1 min，取出晾干后，在（25±1）℃及（6±1）℃下進(jìn)行貯藏試驗(yàn)，每2 d取樣一次。取果囊果汁、勻漿、過(guò)濾，經(jīng)充分混勻后迅速進(jìn)行香氣成分測(cè)定，樣品貯存于–80 ℃中待測(cè)，每個(gè)樣品3組平行。

1.2.2 ?百香果香氣成分的測(cè)定 ?參考郭艷峰[11]方法，略有改動(dòng)。雙極性DVB/CAR/PDMS（50/30 ?m）固相微萃取頭置于GC-MS儀進(jìn)樣口進(jìn)行老化處理，老化溫度250 ℃，老化時(shí)間60 min。取攪勻的百香果汁5 g于20 mL萃取瓶中，將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于40 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出，插入GC-MS進(jìn)樣口。GC-MS分析條件：DB-WAX MS 毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm），He 流量為1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃;升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，然后以8 ℃/min線性升溫至90 ℃，10 ℃/ min線性升溫至230 ℃，在此溫度下保持7 min;離子化方式為電子轟擊電離（EI），離子源溫度230 ℃，電子能量80 eV，接口溫度280 ℃;全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍35～350 u;對(duì)照NIST 2014譜庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用峰面積歸一化法確定相對(duì)含量。

1.2.3 ?酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性測(cè)定 ?（1）LOX活性測(cè)定。參考曹建康等[19]方法，略有改動(dòng)。稱取5 g百香果汁，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），在研缽內(nèi)冰浴研磨成勻漿，于4 ℃12 000 r/min離心30 min，收集上清液用于酶活性測(cè)定。將總體積為2.8 mL的反應(yīng)液[2.775 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）、25 μL 10 mmol/L亞油酸鈉溶液]在30 ℃保溫3 min，與200 μL粗酶液混勻，以蒸餾水為參比調(diào)零，于234 nm處測(cè)定吸光度值，反應(yīng)15 s后開始記錄為初始值，然后每隔30 s記錄一次，結(jié)果以比活性表示（mU/mg）。

（2）AAT活性測(cè)定。取3 g百香果汁，加入6 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7）和0.1 g PVPP，在研缽內(nèi)冰浴研磨成勻漿，于4 ℃。10 000 r/min離心30 min，收集上清液用于酶活性測(cè)定。反應(yīng)液由2.5 mL MgCl2溶液（0.5 mol/L pH 8 Tris-HCl緩沖液中含5 mmol/L MgCl2）、150 μL乙酰輔酶A溶液（0.5 mol/L pH 8 Tris-HCl緩沖液中含5 mmol/L乙酰輔酶A）、50 μL丁醇溶液（0.5 mol/L pH 8 Tris-HCl緩沖液中含200 mmol/L丁醇）組成。將反應(yīng)液與150 μL酶提取液混合后在35 ℃下水浴15 min，加入10 mmol/L 5，5-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）100 μL。室溫下放置10 min后，于412 nm處測(cè)定吸光度值，用不含酶提取液的反應(yīng)液為空白。一個(gè)酶活力單位（U）以1 min吸光度升高值計(jì)算，結(jié)果以比活性表示（mU/mg）[20]。

（3）ADH活性測(cè)定。取5 g百香果汁，加入10 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的提取緩沖液[0.1 mol/L MES- Tris緩沖液（pH 6.5）、2 mmol/L DTT、1% PVP]，在研缽內(nèi)冰浴研磨成勻漿，于4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清液用于酶活性測(cè)定。反應(yīng)液由2.4 mL MES-Tris緩沖液（pH 6.5）、0.15 mL l.6 mmol/L NADH和0.15 mL 80 mmol/L乙醛組成。將反應(yīng)液與300 μL酶提取液在30 ℃下混合后，于340 nm測(cè)定ADH活性。一個(gè)酶活力單位（U）以1 min吸光度升高值計(jì)算，結(jié)果以比活性表示（mU/mg）[21]。

（4）HPL活性測(cè)定。取1 g百香果汁，加入4 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的提取液[150 mmol/L HEPES- KOH緩沖液（pH 8）、250 mmol/L山梨醇、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L MgCl2、l%甘油、4% PVPP和0.1 mmol/L PMSF]，在研缽內(nèi)冰浴研磨成勻漿，于4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，收集上清液用于酶活性測(cè)定。反應(yīng)液由2 mL緩沖液[150 mmol/L HEPES-KOH（pH 8）、250 mmol/L山梨醇、10 mmol/L EDTA和10 mmol/L MgCl2]、0.75 mL 10 mmol/L亞油酸鈉溶液、0.15 mL 1.6 mmol/L NADH、0.1 m ADH酶液、[0.5 mg/mL硼酸緩沖液（pH 8.6）]組成。將反應(yīng)液與500 μL酶提取液在30 ℃下混合后，于340 nm測(cè)定HPL活性。一個(gè)酶活力單位（U）以1 min吸光度升高值計(jì)算，結(jié)果以比活性表示（mU/mg）[21]。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用鄧肯（Duncan）多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同溫度貯藏過(guò)程中百香果香氣成分的動(dòng)態(tài)分析

果實(shí)香氣物質(zhì)形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，是多種揮發(fā)性組分共同作用的結(jié)果。由圖1可知，不同溫度貯藏過(guò)程中百香果香氣物質(zhì)的相對(duì)含量和種類組成明顯變化，酯類、醇類、酮類、醛類、烯烴類、烷烴類、酸類這7類香氣成分在不同溫度貯藏條件下均存在差異。常溫貯藏前期和中期（0～8 d）酯類占總香氣物質(zhì)的50.75%～60.32%;貯藏后期（10～12 d）酯類相對(duì)含量逐漸減少，而醇類相對(duì)含量逐漸增加，在貯藏12 d時(shí)酯類和醇類的相對(duì)含量分別為40.00%和24.74%、種類組成分別為28種和21種;此外，酮類、醛類、烯烴類、烷烴類、酸類及其他類成分的相對(duì)含量分別為7.31%～ 14.47%、0%～1.17%、1.82%～5.85%、0.08%～4.98%、0.77%～2.69%、0%～0.73%。低溫貯藏0～20 d，酯類占總香氣物質(zhì)的54.62%～節(jié)69.27%，其次為醇類（8.52%～14.13%）、酮類（6.78%～14.47%），而醛烴類（0.18%～1.34%）、烯烴類（1.03%～5.85%）、烷烴類（0.44%～5.06%）、酸類（0%～3.26%）及其他類（0.21%～1.42%）成分相對(duì)含量較少。以上說(shuō)明在不同貯藏溫度下，百香果香氣物質(zhì)均以酯類為主，其次是醇類、酮類，而醛類、酸類、烯烴類、烷烴類及其他類成分的相對(duì)含量較少。

酯類具有果香型的感官特征，是果實(shí)中重要的特征芳香物質(zhì)[22]，由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸與醇之間相互作用生成[23]。由圖1A、表1可知，常溫貯藏期間，百香果酯類物質(zhì)相對(duì)含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在4 d時(shí)達(dá)最高值60.32%、種類33種，但在12 d時(shí)下降為40.00%、種類28種;進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，在酯類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是丁酸乙酯（10.30%～12.33%）、正己酸乙酯（1.18%～9.94%）、丁酸己酯（0.15%～8.71%）、乙酸乙酯（2.99%～6.26%）、己酸己酯（0.09%～ 4.56%），其中正己酸乙酯、丁酸己酯、己酸己酯相對(duì)含量變化較大，貯藏中后期快速下降。由圖1A、表2可知，低溫貯藏期間，酯類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸上升、種類數(shù)先上升后下降，整個(gè)貯藏期內(nèi)相對(duì)含量保持在54.62%～69.27%、20 d時(shí)達(dá)最高值69.27%，在10 d時(shí)種類數(shù)達(dá)最高值37種;在酯類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是丁酸乙酯（10.51%～16.25%）、正己酸乙酯（8.45%～15.06%）、丁酸己酯（0.70%～7.90%）、乙酸乙酯（3.65%～ 11.92%）、己酸己酯（0.70%～5.08%）。與常溫貯藏顯著不同的是，低溫貯藏后期乙酸乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯仍保持較高的含量。

醇類通常具有清香型的感官特征[24]。由圖1B、表1可知，常溫貯藏期間，醇類在百香果總香氣物質(zhì)中占比僅次于酯類。醇類物質(zhì)相對(duì)含量在貯藏后期逐漸增加，貯藏12 d時(shí)達(dá)最高值24.74%、種類21種;在醇類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是2-庚醇（0.58%～6.06%）、芳樟醇（1.58%～3.29%）、正辛醇（0.66%～4.73%）。由圖1B、表2可知，低溫貯藏期間，醇類物質(zhì)相對(duì)含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在貯藏8 d時(shí)達(dá)最高值16.11%、種類數(shù)達(dá)最高值19種，在醇類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是芳樟醇（2.07%～3.29%）、2-庚醇（0.42%～3.14%）、正辛醇（0.66%～3.10%）、正己醇（0%～2.30%）。

酮類可能是由于脂肪的熱氧化降解和氨基酸降解而形成[25]。由圖1C、表1可知，總體而言常溫貯藏期間，酮類相對(duì)含量在百香果總香氣物質(zhì)中占比排名第三，在酮類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是β-紫羅酮、L-薄荷酮、二氫-β-紫羅蘭酮、2-庚酮。由圖1C、表2可知，低溫貯藏期間，酮類物質(zhì)相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)，貯藏1 d時(shí)為14.47%、種數(shù)為9種，但20 d時(shí)相對(duì)含量為6.78%、種數(shù)為10種，在酮類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是β-紫羅酮、二氫-β-紫羅蘭酮、2-庚酮。

醛類、烷烴類在百香果貯藏過(guò)程中成分較為單一，相對(duì)含量在百香果總香氣物質(zhì)中占比較低。由圖1D、圖1F和表1可知，常溫貯藏期間醛類僅檢測(cè)出壬醛，貯藏0～12 d相對(duì)含量最高僅為1.17%（0 d）;另外，檢出的烷烴類化合物主要是茶螺烷、（1-甲基丁基）環(huán)丙烷，貯藏0～12 d烷烴類相對(duì)含量最高為4.98%（12 d）。與常溫貯藏相比，低溫貯藏期間鑒定出的醛類、烷烴類化合物種類更多，但主要的醛類化合物也是壬醛（0.13%～1.17%），主要的烷烴類化合物是（1-甲基丁基）環(huán)丙烷、8-丙烷-2-亞烷基雙環(huán)[5.1.0]辛烷、茶螺烷。

烯烴類在百香果不同溫度貯藏期間相對(duì)含量和種類數(shù)均呈下降趨勢(shì)。由圖1E可知，不同溫度貯藏過(guò)程中烯烴類相對(duì)含量最高均為5.85%（0 d）。由表1、2可知，相對(duì)含量最高的化合物均為月桂烯，常溫貯藏期間從1.61%（0 d）降至0.39%（4 d）、貯藏6～12 d未檢出;低溫貯藏期間從1.61%（0 d）降至0.73%（8 d）、貯藏10～20 d未檢出。常溫貯藏期間，相對(duì)含量大于1%的化合物僅檢測(cè)出月桂烯、β-羅勒烯、（E）-Β-羅勒烯、萜品烯;低溫貯藏期間，相對(duì)含量大于1%的化合物僅檢測(cè)出月桂烯、（E）-Β-羅勒烯。

酸類在百香果不同溫度貯藏期間相對(duì)含量較高的化合物均為反式2-己烯基己酸和己酸，由表1、2可知，常溫下反式2-己烯基己酸僅在貯藏0 d時(shí)檢出、己酸僅在貯藏2 d時(shí)檢出;低溫下反式2-己烯基己酸僅在貯藏0～2 d檢出、己酸僅在貯藏12～16 d檢出。

2.2 ?不同溫度貯藏過(guò)程中百香果酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性分析

百香果酯類香氣物質(zhì)是果實(shí)次生代謝產(chǎn)物，是在相關(guān)酶催化下以脂肪酸、氨基酸和單糖為前體物質(zhì)形成的[26]。百香果不同溫度貯藏過(guò)程中酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性的變化見(jiàn)圖2。

果實(shí)LOX活力隨常溫與低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化（P<0.05）。貯藏0 d時(shí)，果實(shí)LOX活力為2.53 mU/mg;常溫條件下果實(shí)的LOX活力在貯藏10 d時(shí)達(dá)最高值8.02 mU/mg，12 d時(shí)降至6.69 mU/mg;低溫貯藏果實(shí)的LOX活力在18 d時(shí)達(dá)最高值6.41 mU/mg，20 d時(shí)降至5.53 mU/mg;表明低溫貯藏可延緩百香果LOX高峰出現(xiàn)。

果實(shí)AAT活力在常溫貯藏期間總體呈先升高后降低趨勢(shì)，在貯藏8 d時(shí)達(dá)最大值1.56 mU/mg。低溫貯藏果實(shí)的AAT活力前期變化緩慢，貯藏中后期逐漸升高而后降低;貯藏0～10 d該酶活力無(wú)顯著差異（P<0.05），從12 d開始上升，16 d時(shí)AAT活力達(dá)到峰值2.75 mU/mg。

果實(shí)ADH活力在常溫貯藏期間總體呈下降趨勢(shì)，中間有波動(dòng)，貯藏0 d時(shí)為最大值0.23 mU/mg，貯藏8～12 d無(wú)顯著差異（P<0.05）;低溫貯藏果實(shí)的ADH活力波動(dòng)較大，總體呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，貯藏4 d時(shí)該酶活力為最小值0.50 mU/mg，18 d時(shí)該酶活力達(dá)到峰值5.46 mU/mg。

果實(shí)HPL活力在常溫與低溫貯藏期間均呈先上升后下降趨勢(shì)，常溫貯藏6 d時(shí)達(dá)最大值2.54 mU/mg;低溫貯藏前期變化較為緩慢，貯藏0～10 d該酶活力無(wú)顯著差異（P<0.05），貯藏18 d達(dá)最高值2.38 mU/mg。

2.3 ?百香果酯類香氣化合物與其代謝關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析

常溫與低溫貯藏百香果果實(shí)中，主要香氣成分酯類化合物與其代謝關(guān)鍵酶LOX、AAT、ADH、HPL活性的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。常溫貯藏條件下，LOX活性與3-羥基丁酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯的相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與乙酸乙酯、乙酸甲酯、（Z）-巴豆酸乙酯、3-羥基己酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與3，7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯的相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與乙酸丁酯、乙酸己酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、己酸己酯、庚酸2-庚酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。AAT活性與丁酸乙酯、2-己烯酸乙酯、乳酸乙酯、巴豆酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與丁酸甲酯、乙酸丁酯的相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與正己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、乙酸順式-3-己烯酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。ADH活性與正己酸乙酯的相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與乙酸丁酯、己酸甲酯、乙酸己酯、辛酸己酯、乙酸順式-3-己烯酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。HPL活性與丁酸庚酯、（Z）-己酸-3-己烯酯、辛基己酸酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），但與己酸-1-甲基己酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

低溫貯藏條件下，LOX活性與乙酸乙酯、辛酸乙酯、3-羥基己酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-羥基十三烷酸乙酯的相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與丁酸乙酯、正己酸乙酯、乳酸乙酯、（Z）-巴豆酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與庚酸2-庚酯、己酸-1-甲基己酯的相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與丁酸甲酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、3，7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯、3-羥基丁酸叔丁酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。AAT活性與辛酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯的相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與乙酸乙酯、正己酸乙酯、乳酸乙酯、3-羥基己酸乙酯、（Z）-巴豆酸乙酯、3-羥基十三烷酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與庚酸2-庚酯的相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與3-羥基丁酸叔丁酯、己酸-1-甲基己酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。ADH活性與正己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-羥基十三烷酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與庚酸2-庚酯的相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與己酸-1-甲基己酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。HPL活性與乳酸乙酯的相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、3-羥基己酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、（Z）-巴豆酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯的相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;但與丁酸甲酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、3，7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯、3-羥基丁酸叔丁酯、庚酸2-庚酯、己酸-1-甲基己酯的相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 ?討論

果實(shí)香氣物質(zhì)形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，在貯藏過(guò)程中其種類和含量變化與果實(shí)品種和采后存貯條件密切相關(guān)。百香果果實(shí)香氣主要是酯類物質(zhì)，為果香型香氣的主要成分，果汁中的酯類物質(zhì)含量越高，香味越強(qiáng)烈。Macoris等[7]報(bào)道了百香果果肉共含77種揮發(fā)性化合物，主要以丁酸甲酯、乙酸丁酯、己醛、丁酸丁酯、反式-3-己烯乙酸酯、順式-3-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯等酯類為主要揮發(fā)性化合物。潘葳等[10]研究鑒定了5個(gè)不同品種的百香果果汁中共含有68種香氣成分，均以酯類物質(zhì)含量最高，其次為醇類、酮類、萜烯類、烷類、醚類和雜環(huán)類;而香氣物質(zhì)含量較高的是丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸己酯等。陳慶等[27]研究也發(fā)現(xiàn)紫紅百香果含有酯類43種、醇類11種、醛類3種、酮類8，其中酯類含量最高，而酯類物質(zhì)則以己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯為主。韓素芳等[28]采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析百香果香氣成分，檢出63種揮發(fā)性化合物，其中丁酸己酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯相對(duì)含量較高。但前期研究均未闡明不同貯藏溫度下百香果香氣物質(zhì)種類和含量的變化規(guī)律，實(shí)際上貯藏溫度能顯著影響香氣物質(zhì)代謝，在不同溫度條件下其種類和含量具有較大差別。在本研究中，采用不同溫度貯藏百香果果實(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果汁香氣成分均以酯類為主，其次為醇類、酮類、醛類、烯烴類、烷烴類、酸類等，且酯類物質(zhì)在常溫（25 ℃）和低溫（6 ℃）貯藏條件下相對(duì)含量較高的均是丁酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸己酯、乙酸乙酯、己酸己酯。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏并不影響百香果的主要香氣成分組成，但影響著香氣成分比例的變化。百香果總香氣物質(zhì)和酯類的相對(duì)含量在常溫貯藏期間呈先上升后逐漸下降趨勢(shì)，分別于2 d（99.43%）、4 d（60.32%）達(dá)到峰值;二者在低溫貯藏期間呈逐漸上升趨勢(shì)，分別于8 d（96.22%）、29 d（69.27%）達(dá)到最高值，因此低溫延緩了百香果的香氣揮發(fā)性物質(zhì)的形成，并維持較高含量。這與邵青旭[29]發(fā)現(xiàn)10 ℃低溫處理可減緩甜瓜果實(shí)酯類物質(zhì)含量的降低速度結(jié)論相似，推測(cè)在低溫條件下果實(shí)可能通過(guò)增加香氣物質(zhì)含量來(lái)抵抗脅迫以適應(yīng)不良低溫環(huán)境，這是果實(shí)在逆境條件下的一種自我保護(hù)機(jī)制[29]。

揮發(fā)性物質(zhì)的代謝途徑比較復(fù)雜，參與代謝關(guān)鍵酶也比較復(fù)雜。果實(shí)香氣物質(zhì)是由組織中一些前體物質(zhì)在酶的催化作用下，通過(guò)一定的生化途徑形成的。百香果主要香氣物質(zhì)是酯類，前人研究已證實(shí)，酯類代謝途徑關(guān)鍵酶LOX、AAT、ADH和HPL在果實(shí)成熟過(guò)程中對(duì)酯類香氣物質(zhì)形成起重要作用[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏前期LOX、AAT和HPL活性變化不大，在貯藏后期表現(xiàn)活躍，但活性峰值出現(xiàn)時(shí)間遲于常溫貯藏，表明低溫可以有效抑制酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性。陳麗[18]、陶淑華等[33]研究均發(fā)現(xiàn)低溫貯藏能夠抑制獼猴桃中的LOX、HPL、ADH、AAT等關(guān)鍵酶活性，這與本研究結(jié)論一致。酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性在低溫貯藏后期表現(xiàn)活躍，這與香氣物質(zhì)尤其是酯類物質(zhì)的相對(duì)含量變化趨勢(shì)相符合。另外，本研究結(jié)果表明百香果酯類香氣化合物與其代謝關(guān)鍵酶活性密切相關(guān)。在張莉會(huì)等[34]草莓酯類香氣化合物及其相關(guān)酶活性研究中也發(fā)現(xiàn)酯類香氣物質(zhì)與LOX、AAT、ADH有著顯著正相關(guān)性，與本研究的結(jié)論一致。由于酯類香氣成分生成于以脂肪酸、氨基酸和單糖為前體的代謝途徑。脂肪酸是大多數(shù)直鏈酯類香氣成分的前體，LOX以不飽和脂肪酸為底物生成氫過(guò)氧化物，在HPL催化下生成己醛和己烯醛，然后在ADH作用下生成醇類物質(zhì)，醇類物質(zhì)作為受體，最后在AAT作用下合成酯類物質(zhì)[35-36]。氨基酸是大多數(shù)支鏈酯類香氣成分的前體，首先通過(guò)脫氨酶和氧化酶的轉(zhuǎn)氨作用形成支鏈酮酸，然后在脫羧酶或脫氨酶作用下生成支鏈醇，最后支鏈醇與?；贏AT的作用下形成支鏈酯類香氣成分[37-38]。

果實(shí)香氣形成是一個(gè)復(fù)雜的代謝過(guò)程，香氣因水果種類或品種不同而存在差異，百香果果實(shí)香氣形成的生理機(jī)制和基因表達(dá)模式尚未闡明，今后應(yīng)對(duì)百香果香氣的形成與代謝途徑及相關(guān)酶生理功能進(jìn)行重點(diǎn)研究，并通過(guò)香氣物質(zhì)合成相關(guān)酶基因克隆與表達(dá)分析，在分子水平上調(diào)控香氣物質(zhì)的合成，從而深刻認(rèn)識(shí)百香果香氣形成機(jī)理，最終達(dá)到控制特征香氣合成、提高果實(shí)品質(zhì)的目的。

4 ?結(jié)論

百香果在常溫（25 ℃）和低溫（6 ℃）貯藏期間，果汁中香氣物質(zhì)均以酯類為主，其相對(duì)含量分別占總香氣物質(zhì)的40.00%～60.32%、54.95%～69.27%，其次是醇類和酮類。在酯類物質(zhì)中相對(duì)含量較高的化合物是丁酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸己酯、乙酸乙酯、己酸己酯。百香果酯類物質(zhì)相對(duì)含量在常溫貯藏4 d時(shí)出現(xiàn)峰值（60.32%），在貯藏中后期（6～12 d）從55.80%降至40.00%;而在低溫貯藏中酯類物質(zhì)相對(duì)含量延至20 d時(shí)才出現(xiàn)峰值（69.27%），在貯藏中后期（10～20 d）維持在61.92%～69.27%，表明低溫貯藏可以維持酯類物質(zhì)較高的相對(duì)含量。對(duì)酯類代謝途徑關(guān)鍵酶活性分析發(fā)現(xiàn)，LOX、AAT和HPL在低溫貯藏前期活性變化不大，貯藏后期表現(xiàn)活躍，最高值出現(xiàn)時(shí)間遲于常溫貯藏，表明低溫可以有效抑制酯類代謝關(guān)鍵酶活性。酯類香氣化合物與其代謝關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析顯示，LOX、AAT、ADH、HPL活性與酯類香氣物質(zhì)相對(duì)含量具有較強(qiáng)相關(guān)性。本研究為百香果采后品質(zhì)保持和保鮮技術(shù)提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Wyckhuys K， Korytkowski C， Martinez J， et al. Species composition and seasonal occurrence of Diptera associated with passionfruit crops in Colombia[J]. Crop Protection， 2012， 32： 90-98.

[2] Jimenez A M， Sierra， C A， Rodriguez-pulido F J， et al. Phy-sicochemical characterisation of gulupa （Passiflora edulis Sims. fo edulis） fruit from Colombia during the ripening[J]. Food Research International， 2011， 44（7）： 1912-1918.

[3] 成文韜， 袁啟鳳， 肖圖艦， 等. 西番蓮果實(shí)生物活性成分及生理功能研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技， 2018， 39（16）： 346-351.

[4] 崔忠吉. 廣西百香果種植現(xiàn)狀及存在問(wèn)題[J]. 農(nóng)家參謀， 2018， （19）： 108， 94.

[5] 謝林婧， 林碧英， 鄭誠(chéng)樂(lè). 福建百香果產(chǎn)業(yè)歷史、現(xiàn)狀及發(fā)展若干思考[J]. 福建熱作科技， 2017， 42（4）： 57-59.

[6] 張佳艷， 任仙娥. 西番蓮果汁的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（11）： 219-224.

[7] Macoris M S， Janzantti N S， Gattuti D S， et al. Volatile compounds from organic and conventional passion fruit （Passiflora edulis F. Flavicarpa） pulp[J]. Food Science and Technology， 2011， 31（2）： 430-435.

[8] Porto-Figueira P， Freitas A， Cruz C J， et al. Profiling of passion fruit volatiles： An effective tool to discriminate between species and varieties[J]. Food Research International， 2015， 77： 408-418.

[9] Janzantti N S， Macorism S， Garrutid S， et al. Influence of the cultivation system in the aroma of the volatile compounds and total antioxidant activity of passion fruit[J]. LWT - Food Science and Technology， 2012， 46（2）： 511-518.

[10] 潘 ?葳， 劉文靜， 韋 ?航， 等. 不同品種百香果果汁營(yíng)養(yǎng)與香氣成分的比較[J]. 食品科學(xué)， 2019， 40（22）： 277-286.

[11] 郭艷峰， 吳惠嬋， 夏 ?雨， 等. 百香果不同發(fā)育階段果汁揮發(fā)性成分研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 32（3）： 299-304.

[12] 申濟(jì)源. 基于LOX途徑的果實(shí)香氣物質(zhì)形成與調(diào)控解析[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2013： 2-5.

[13] Liu H， Song L， You Y， et al. Cold storage duration affects litchi fruit quality， membrane permeability enzyme activities and energy charge during shelf time at ambient temperature[J]. Postharvest Biology Technology， 2011， 60（1）： 24-30.

[14] 王 ?龍， 周 ?鑫， 盛 ?蕾， 等. 冷藏對(duì)南果梨酯類香氣合成關(guān)鍵酶活性及蛋白表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38（9）： 207-212.

[15] Leone A， Bleve-zacheo T， Gerardi C， et al. Lipoxygenase involvement in ripening strawberry[J]. Journal of Agricul-tural and Food Chemistry， 2006， 54（18）： 6835-6844.

[16] Anadreou A， Feussner I. Lipoxygenases： structure and reaction mechanism[J]. Phytochemistry， 2009， 70（13-14）： 1504-1510.

[17] 梁銀娜， 李 ?寶. 柿果實(shí)乙醇脫氫酶酶學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 16（5）： 65-70.

[18] 陳 ?麗. 美味獼猴桃采后果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)變化的研究[D]. 杭州： 浙江工商大學(xué)， 2018： 6-8.

[19] 曹建康， 姜微波， 趙玉梅. 果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 中國(guó)輕工業(yè)出版社， 2007： 105-107.

[20] 張 ?琳. 乙烯對(duì)1-MCP處理的獼猴桃香氣與醇?；D(zhuǎn)移酶活性及基因表達(dá)的影響[D]. 西安： 陜西師范大學(xué)， 2013： 21-22.

[21] 劉鑫泉. 菠蘿蜜果實(shí)香味物質(zhì)形成相關(guān)酶活性及基因表達(dá)分析[D]. 湛江： 廣東海洋大學(xué)， 2016： 9-10.

[22] 陳 ?燕， 孫曉紅， 孫國(guó)偉， 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜分析藍(lán)莓粗提物中的揮發(fā)性成分[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（20）： 78-81.

[23] Ai J. Headspace solid phase microextration. Dynamics and quantitative analysis before reaching a partition equili-brium[J]. Analytical Chemistry， 1997， 69（16）： 3260-3266.

[24] 張曉萌. 桃果實(shí)成熟過(guò)程中香氣成分形成及其生理機(jī)制研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2005： 4-6.

[25] Du L， Li J， Li W， et al. Characterization of volatile com-pounds of pu-erh tea using solid-phase microextractionand simultaneous distillation-extraction coupled with gas chro-matography-mass spectrometry[J]. Food Research Interna-tional， 2014， 57： 61-70.

[26] 張麗萍. 冷藏及1-MCP處理對(duì)南果梨揮發(fā)性香氣物質(zhì)代謝的影響及其調(diào)控[D]. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013： 31-32.

[27] 陳 ?慶， 賈 ?強(qiáng)， 董 ?浩， 等. 紫紅百香果果汁揮發(fā)性香氣分析及仿香研究[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2018， 34（12）： 258-263.

[28] 韓素芳， 丁 ?明， 劉亞群， 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定百香果香氣條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2010， 10（4）： 278-284.

[29] 邵青旭. 低溫貯藏對(duì)薄皮甜瓜風(fēng)味品質(zhì)的影響[D]. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019： 1-2， 35-36.

[30] Both V， Brackmann A， Thewes F R， et al. Effect of storage under extremely low oxygen on the volatile composition of ‘Royal Gala apples[J]. Food Chemistry， 2014， 156： 50-57.

[31] Xi W P， Zhang B， Shen J Y， et al. Intermittent warming alleviated the loss of peach fruit aroma-related esters by regulation of AAT during cold storage[J]. Postharvest Biol-ogy and Technology， 2012， 74（6）： 42-48.

[32] 周 ?鑫. 冷藏及1-MCP處理對(duì)南果梨酯類香氣影響的分子機(jī)制及香氣“喚醒”研究[D]. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015： 7-8.

[33] 陶淑華， 陳 ?麗， 蔣鎮(zhèn)燁， 等. 低溫貯藏對(duì)美味獼猴桃布魯諾果實(shí)主要揮發(fā)性物質(zhì)和脂肪酸代謝的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2020， 34（2）： 288-297.

[34] 張莉會(huì)， 汪 ?超， 廖 ?李， 等. 草莓干燥過(guò)程中酯類香氣化合物及相關(guān)酶活性的變化[J]. 食品科學(xué)， 2020， 41（4）： 172-177..

[35] Rowan D D， Allen J M， Fielder S， et al. Biosynthesis of straight-chain ester volatiles in red delicious and granny smith apples using deuterium-labeled precursors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（7）： 2553- 2562.

[36] 廖鳳玲， 汪志輝， 熊 ?博， 等. 愛(ài)甘水梨果實(shí)發(fā)育過(guò)程香氣形成與代謝關(guān)鍵酶活性的關(guān)系[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2014， 29（2）： 152-155.

[37] Rowan D D， Lane H P， Allen J M， et al. Biosynthesis of 2-methylbutyl， 2-methyl-2-butenyl， and 2-methylbutanoate esters in red delicious and granny smith apples using deute-rium-labeled substrates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1996， 44（10）： 3276-3285.

[38] 譚 ?卓. 基于脂肪酸代謝的冷藏南果梨香氣變淡機(jī)理及調(diào)控研究[D]. 沈陽(yáng)： 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018： 7-10.

責(zé)任編輯：崔麗虹