薛耀威 陳麗蘭 王亞如 高三基 王錦達(dá)

摘 ?要：丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）是茉莉酸合成途徑的一個關(guān)鍵酶，在植物防御反應(yīng)中起著重要的作用。本研究基于甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫克隆到一個AOC基因，命名為ScAOC，并對其進(jìn)行生物學(xué)分析、組織特異性分析和逆境脅迫下的表達(dá)分析，以初步了解該基因的功能。甘蔗ScAOC基因的開放閱讀框（ORF）為744 bp，編碼244個氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量是26.37 kDa。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，ScAOC蛋白屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白，含有1個Allene_ox_cyc Superfamily的PLN02343 domain的保守結(jié)構(gòu)域;構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示ScAOC蛋白與高粱的蛋白具有較高的同源性。熒光定量PCR結(jié)果顯示，ScAOC基因在甘蔗的根、莖、葉中均有表達(dá)，表達(dá)量從高到低依次是葉、根、莖。在PEG、NaCl及外源MeJA脅迫下，ScAOC基因相對表達(dá)量都是先上升后下降，而ABA對ScAOC的表達(dá)有一定的抑制作用。在病原菌和粘蟲取食的脅迫下，ScAOC基因相對表達(dá)量顯著上升。結(jié)果顯示ScAOC可能參與甘蔗對生物或非生物脅迫的防御反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：甘蔗;丙二烯氧化物環(huán)化酶;茉莉酸;生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S566.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Allene oxide cyclase （AOC） is a key enzyme in the synthesis pathway of jasmonic acid and plays an important role in plant defense reactions. In this study， an AOC gene was cloned based on the sugarcane transcriptome database and named ScAOC. Biological analysis， tissue-specific analysis， and expression analysis under stress were conducted to understand the preliminary function of the gene. The open reading frame （ORF） of the ScAOC gene in sugarcane was 744 bp， encoding 244 amino acids， and its protein molecular mass was 26.37 kDa. Bioinformatics analysis showed that the ScAOC protein was an unstable basic hydrophilic protein and contained a conserved domain of the PLN02343 domain of Allene_ox_cyc Superfamily. Constructing a phylogenetic tree showed that the ScAOC protein has a high homology with sorghum protein. Fluorescence quantitative PCR showed that the ScAOC gene was expressed in the roots， stems and leaves of sugarcane， and the expression levels from high to low were leaves， roots and stems. Under the stress of PEG， NaCl and exogenous MeJA， the relative expression of ScAOC gene increased first and then decreased， and ABA had a certain inhibitory effect on the expression of ScAOC. Under the stress of pathogenic bacteria and armyworm feeding， the relative expression of ScAOC gene increased significantly. The results showed that ScAOC maight be involved in the defense response of sugarcane to biological or abiotic stress.

Keywords： sugarcane; allene oxide cyclase; jasmonic acid; bioinformatics analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.007

甘蔗是我國最主要的糖料作物，甘蔗產(chǎn)糖占我國食糖總量的90%左右[1]，此外甘蔗也是重要潛在的能源作物，因此甘蔗的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)是事關(guān)國計民生的大事。甘蔗屬于多年生作物，生產(chǎn)周期較長，且長期連作，經(jīng)常受到各種不良環(huán)境的威脅，導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量降低，蔗汁品質(zhì)下降。而目前田間管理上多通過噴施化學(xué)肥料和農(nóng)藥的方法，提高甘蔗抵御外界各種脅迫。地球資源短缺，環(huán)境惡化，環(huán)境保護(hù)和食品安全的重要性日益突顯，未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)勢必向無毒、綠色環(huán)保的方向發(fā)展。選育和利用抗逆品種，是目前公認(rèn)提高農(nóng)作物抗逆性最根本、經(jīng)濟(jì)有效且對環(huán)境影響最小的辦法。利用品種對外界環(huán)境的不敏感性，提升農(nóng)作物對各種生物脅迫的忍受能力，并降低各種有害生物的生存適合度，不但有利于農(nóng)作物抵抗外界不良脅迫，也有利于減少環(huán)境污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。

茉莉酸類化合物（Jasmonates，JAs）是一類基本的植物激素，作為植物體內(nèi)的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的生長過程中有十分重要的作用。一方面JAs可通過調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)[2]、器官發(fā)育[3]和衰老死亡[4]等;另一方面JAs還可參與植物的生物脅迫和非生物脅迫[5]，如逆境脅迫[6]、病原菌侵?jǐn)_[7]等過程。在植物體內(nèi)JAs通過亞麻酸或亞油酸為底物經(jīng)過各種酶促反應(yīng)合成[8]。其中丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因是茉莉酸生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶基因，能夠通過特異性地催化丙二烯氧化物[12，13（s）-epoxy-（9Z，11E，15Z）-octade-catrienoic acid， 12，13-EOT]形成茉莉酸產(chǎn)物的前體1，2-氧-植物二烯酸[12-oxo-phytodienoic acid，OPDA][9]，其活性在中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為茉莉酸的過程中起重要作用[10]。已有研究顯示，AOC可通過提高表達(dá)促進(jìn)JAs的形成，提高植物抵抗外界不良環(huán)境脅迫的能力。因此分離AOC基因并分析其表達(dá)規(guī)律對于研究該基因在植物生長發(fā)育和抵御外界脅迫的過程中的作用具有重要的意義。自2000年首個AOC基因在番茄中克隆報道以來[11]，該基因已經(jīng)在玉米[12]、擬南芥[13]等多種植物中克隆得到，并對其進(jìn)行了相關(guān)功能研究。而目前尚未有甘蔗中AOC基因的研究報道，因此對甘蔗AOC基因進(jìn)行全長克隆分析，并研究在外界生物脅迫和非生物脅迫下AOC基因的表達(dá)規(guī)律，為揭示AOC基因在甘蔗茉莉酸生物合成過程中的作用以及分析甘蔗的生長發(fā)育和防御反應(yīng)的分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料及處理 ?本實驗采用由福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心提供的新臺糖22號（ROC22）甘蔗品種。采集新鮮的根莖葉，提取總RNA，檢測ScAOC基因在不同部位以及逆境脅迫下的表達(dá)差異。從蔗田挑選漲勢健壯一致的甘蔗種莖切斷，然后進(jìn)行30 min溫水（52 ℃，含1 g/L多菌靈）脫毒處理，然后放入培養(yǎng)箱（30 ℃，光照16 h，濕度65%）中催芽，分別經(jīng)4種外源激素處理：0.1 mmol/L的ABA處理0、12、24 h （CK、ABA-12 h、ABA-24 h）;25% PEG6000干旱處理0、6、12 h（CK、PEG-6 h、PEG-12 h）;250 mmol/L的高鹽（NaCl）脅迫處理0、12、24 h（CK、NaCl-12 h、NaCl-24 h）;100 ?mol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）處理0、12、24 h（CK、MeJA- 12 h、MeJA-24 h）。2種生物脅迫：赤條菌（Acidovorax avenae subsp. avenae，Aaa）處理0、24、48 h（CK、Aaa-24 h、Aaa-48 h）;粘蟲取食（Insect）處理0、12、24 h（CK、Insect-12 h、Insect-24 h）。然后提取RNA檢測ScAOC基因在不同脅迫下的表達(dá)差異性。

1.1.2 ?試劑 ?實驗所用主要試劑：PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國，大連）、TRIzol Reagent（Invitrogen，美國，卡爾斯巴德）、Gel Extraction Kit（天根生化科技有限公司，中國，北京），基因克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit載體（全式金，中國，北京）、基因克隆試劑Prime-STAR? GXL Premix Kit（TaKaRa，中國，大連）等。

1.2 ? 方法

1.2.1 ?RNA提取 ?按照TRIzol Reagent RNA提取試劑盒的操作步驟對各處理材料進(jìn)行RNA的提取，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，保存于–80 ℃超低溫冰箱。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行，并保存于–80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2 ?ScAOC基因的引物設(shè)計與克隆 ?根據(jù)本實驗室測序得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表）篩選到甘蔗ScAOC的unigene序列，通過在線軟件Primer 5.0進(jìn)行基因特異性克隆引物的設(shè)計（表1）。將cDNA作為目的基因的克隆模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將得到的目的片段經(jīng)回收、連接和克隆后經(jīng)過挑單菌落菌液PCR檢測，最后送福州博尚測序公司進(jìn)行測序。

1.2.3 ?ScAOC的生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI的ORF Finder在線程序分析測序獲得的目的基因核酸序列的開放閱讀框（open reading frame， ORF）;利用NCBI的Conserved domains database （CDD）數(shù)據(jù)庫對基因蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測;利用在線軟件Protparam、GOR IV、SWISS MODEL對基因蛋白進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用DNAMAN軟件對7個物種的AOC基因進(jìn)行多序列比對，通過NPS的proscan（https：//npsa- pra-bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_proscan.html）對ScAOC進(jìn)行活性位點預(yù)測;利用MEGA對基因蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.2.4 ?ScAOC基因在不同組織和不同脅迫下的表達(dá)分析 ?采用SYBR Green染料法，分析ScAOC在根、莖、葉中的表達(dá)特異性及在不同脅迫下的表達(dá)差異。以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceral-dehyde-phosphate dchydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因[14-15]。每個樣品以無菌水為對照，設(shè)置3次重復(fù)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量計算采用2-ΔΔCT算法，基因的相對表達(dá)量為扣除0 h對照組的基因相對表達(dá)水平。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?ScAOC基因的鑒定及序列分析

本研究克隆了ScAOC基因的全長，該序列包括744 bp的開放閱讀框（圖1），編碼244個氨基酸，GenBank號為：MK784561。通過對ScAOC進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示該基因編碼蛋白的理論相對分子量為26.37 kDa，理論等電點為9.45，不穩(wěn)定系數(shù)為45.06，平均疏水性為–0.250，脂肪系數(shù)（AI）為80.45（表2）。推測ScAOC屬于不穩(wěn)定堿性親水蛋白。

ScAOC基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明（表3），該二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲，占比為54.10%;其次為23.77%的α-螺旋和22.13%的延伸鏈，不含β-螺旋結(jié)構(gòu)。

SWISS MODEL的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示（圖2A），ScAOC基因三級結(jié)構(gòu)元件主要是無規(guī)則卷曲。且ScAOC主要含有一個Allene_ox_cyc Superfamily的PLN02343 domain的保守結(jié)構(gòu)域（圖2B）。

2.2 ?ScAOC蛋白序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN軟件對7個物種的AOC蛋白序列進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)（圖3），這些AOC蛋白中包含8個高度保守的β延伸鏈結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過NPS（Network Protein Sequence Analysis）對ScAOC進(jìn)行活性位點預(yù)測，結(jié)果表明ScAOC蛋白有6個活性位點，為N-糖基化位點、蛋白酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-十四?；稽c、酪氨酸激酶磷酸化位點、酰胺化位點。

將ScAOC與其他22種植物的AOC基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示單子葉植物的AOC蛋白相對雙子葉植物獨(dú)立于一簇，且甘蔗ScAOC蛋白與高粱在同一個小分支上，親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.3 ?ScAOC基因在甘蔗不同組織部位的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ScAOC基因在甘蔗的根、莖、葉中均有表達(dá)。表達(dá)量從高到低依次是葉、根、莖，其中ScAOC在葉中的表達(dá)量是莖的1.31倍，且表達(dá)差異不顯著（圖5）。

2.4 ?ScAOC基因在不同脅迫下的表達(dá)分析

2.4.1 ?非生物脅迫下ScAOC的相對表達(dá)量 ?從圖6可知，在4種非生物脅迫處理下，ABA處理后ScAOC出現(xiàn)先下降后上升變化，而其他3種處理則出現(xiàn)相反趨勢。其中在ABA處理下ScAOC的表達(dá)量變化幅度不大，甚至在12 h時下降到對照組的0.82倍，24 h時表達(dá)量上升到對照組的

1.47倍;而在25%的PEG6000干旱處理下其表達(dá)水平迅速上調(diào)，在6、12 h時分別達(dá)到了對照組的6.17、4.64倍;在NaCl脅迫下，在12、24 h時分別達(dá)到了對照組的3.96、2.63倍;在100 ?mol/L的MeJA處理下，組織相對表達(dá)量在12、24 h時分別達(dá)到了對照組的1.93、1.84倍，且差異顯著。

2.4.2 ?生物脅迫下ScAOC的相對表達(dá)量 ?通過接種病原菌和粘蟲取食2種生物脅迫，ScAOC的表達(dá)量呈現(xiàn)相同上升趨勢。其中病原菌脅迫處理24、48 h時ScAOC的表達(dá)量分別達(dá)到了對照組的2.09、2.34倍;粘蟲取食12、24 h時ScAOC的表達(dá)量分別達(dá)到了對照組的2.5、4.0倍（圖7）。

3 ?討論

茉莉酸廣泛存在于植物的幼嫩組織和發(fā)育的生殖器官中[16]，是一種通過韌皮部篩管長距離運(yùn)輸?shù)男盘栁镔|(zhì)[17]，在植物體內(nèi)充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)[18]。本實驗以甘蔗品種為新臺糖22號（ROC22）為模板，克隆并得到了甘蔗AOC基因，該基因全長744 bp，編碼244個氨基酸。根據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ScAOC基因含有1個保守的allene-ox-cyc結(jié)構(gòu)，聚類分析表明該蛋白與玉米、高粱等植物的AOC具有較高的氨基酸序列度相似性。通過研究甘蔗中ScAOC基因的序列特征和表達(dá)特性，將為深入研究ScAOC在甘蔗中的作用奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的AOC基因在不同組織部位的表達(dá)存在差異。如Stenzel等[19]發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片中，AtAOC1和AtAOC2具有較高的表達(dá)量，但是在花中AtAOC3表達(dá)量最高，在根中AtAOC4表達(dá)量較高;在曹晏彬等[20]發(fā)現(xiàn)在蘋果中MdAOC1基因在莖部高表達(dá);而劉曉慧等[21]發(fā)現(xiàn)在金魚草AmAOC在花中表達(dá)量最高，而在根中最低。本研究中我們發(fā)現(xiàn)ScAOC基因在甘蔗各部位均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量最高。

大量研究顯示，AOC在植物對非生物脅迫的防御反應(yīng)中起著重要作用。在植物生長發(fā)育過程中，最常見的非生物脅迫有機(jī)械損傷、干旱、低溫、高鹽等。當(dāng)番茄收到機(jī)械損傷，可在其葉片上檢測到AOC基因表達(dá)量的升高[22];當(dāng)高鹽或低溫處理麻風(fēng)樹時，發(fā)現(xiàn)JaAOC表達(dá)量快速上升[23]。而本實驗所研究的4種非生物脅迫，ScAOC對其均有應(yīng)答，其中在PEG脅迫下表達(dá)最迅速且相對表達(dá)量達(dá)到了4種脅迫中的最高值，為對照組的6.17倍，其次為NaCl脅迫。MeJA作為茉莉酸甲基化后的產(chǎn)物，參與了茉莉酸類物質(zhì)的生物合成途徑，在植物抗蟲抗病上的作用頗為顯著。在蘋果[20]、白木香[18]中發(fā)現(xiàn)噴施茉莉酸甲酯后，對應(yīng)的AOC基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，這與我們的研究結(jié)果一致，只是表達(dá)峰值出現(xiàn)在不同時間點，這也說明了不同植物AOC基因?qū)υ摷に靥幚碛胁煌谋磉_(dá)模式。我們認(rèn)為外源刺激是短暫且非持久的，過多的JA積累觸發(fā)了植物體內(nèi)自我保護(hù)機(jī)制，從而抑制了植物體內(nèi)AOC基因的持續(xù)高表達(dá)。而在ABA處理12 h時的相對表達(dá)量為對照組的0.82倍，出現(xiàn)抑制表達(dá)情況，同樣在研究水稻OsAOC的表達(dá)量時發(fā)現(xiàn)ABA對其有明顯抑制[24]，植物體內(nèi)其他激素生物合成途徑對JA信號途徑的影響錯綜復(fù)雜，具體機(jī)制目前尚不清楚。綜合我們的研究結(jié)果顯示，鹽、干旱等外界不良環(huán)境的脅迫可以改變ScAOC的表達(dá)，且多種激素參與AOC的表達(dá)調(diào)控，但是不同植物的調(diào)控過程和機(jī)理可能有所差異。

此外，AOC在植物防御生物脅迫的過程中也起著重要的作用。呂麗敏[25]等在甜菜夜蛾取食12 h后的棉花中檢測發(fā)現(xiàn)GhAOC表達(dá)量明顯上升，達(dá)到對照組的4.0倍，差異極顯著;而在番茄受棉鈴蟲咬食的脅迫實驗中發(fā)現(xiàn)，番茄在被取食3 h時后體內(nèi)AOC表達(dá)水平達(dá)到頂峰，且JA類物質(zhì)大量合成[26];此外JA類信號物質(zhì)可以短時間內(nèi)在受傷植株的受傷部位以及未受傷部位大量合成，來應(yīng)對外界刺激如病原菌感染、昆蟲取食等并做出快速響應(yīng)，產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控植物的抗性[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)甘蔗在生物脅迫（粘蟲取食和病原菌）下，體內(nèi)ScAOC基因表達(dá)水平均明顯提高。因此我們認(rèn)為甘蔗受到外界的生物脅迫下也能夠迅速通過AOC基因表達(dá)量的提高，合成JA類物質(zhì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，阻止外界病原和昆蟲的進(jìn)一步取食以達(dá)到自我防御的作用。

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責(zé)任編輯：黃東杰