楊婷，李婭嫻，李亞東，嚴(yán)皎，王永蓉，趙勇，文瑜，杜宋婷，劉正玲

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650503

目前，ELISA法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生產(chǎn)實踐及科研中，針對抗原或抗體的檢測方法具有高度特異性、靈敏度及高通量等特性。穩(wěn)定性是體外診斷試劑必備的基本屬性，是確保產(chǎn)品在使用過程中安全有效的重要指標(biāo)［1-2］，相關(guān)研究是體外診斷試劑盒注冊申報資料中重要內(nèi)容之一，也是確定試劑盒保存條件、有效期的唯一依據(jù)［3］。

包被固相載體的抗原在環(huán)境中的穩(wěn)定性是影響ELISA試劑盒質(zhì)量的重要因素。DESHPANDE［4］研究證實，抗原結(jié)合在聚苯乙烯塑料表面10 d后，約90%的抗原位點發(fā)生變性。選擇能夠延緩固相抗原抗體變性的環(huán)境條件是延長檢測板有效期、維持穩(wěn)定性的便捷手段。ELISA試劑盒的生產(chǎn)和貯存過程中，通常采用干燥和低溫環(huán)境來延長檢測板的貯存期，目前多家企業(yè)開發(fā)出相應(yīng)的ELISA檢測體系進(jìn)行腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）抗原定量檢測［5-6］，其中檢測板多為干燥密封保存于-20或-60℃以下的預(yù)包板，或現(xiàn)包現(xiàn)用檢測板，鮮有采用緩沖液進(jìn)行濕保存預(yù)包板的相關(guān)研究。因此，本研究采用干燥保存和濕保存兩種方法保存EV71抗原含量檢測板，于不同保存時間檢測不同抗原含量的EV71樣品，通過統(tǒng)計學(xué)分析，評價兩種方法保存EV71抗原檢測板的穩(wěn)定性，以期為生產(chǎn)廠家及檢定機(jī)構(gòu)自制EV71抗原ELISA試劑盒提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品 EV71抗原檢測國家標(biāo)準(zhǔn)品（20100701）購自中國食品藥品檢定研究院；EV71收獲液（樣品1和2，含量分別為320和300 U／mL）、EV71原液（樣品3和4，含量分別為7 050和710 U／mL）、EV71半成品（樣品5，含量為250 U／mL）均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器 牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）購自北京索萊寶科技有限公司；Tween 20購自美國Amresco公司；顯色液購自美國KPL公司；HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG購自美國Thermo公司；甘油購自四川西隴科學(xué)有限公司；抗體保護(hù)劑購自德國Candor公司；碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）、PBS、酶稀釋液、羊及兔抗EV71多克隆抗體由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所質(zhì)量檢定室制備；96孔板購自美國Corning Costar公司。

1.3 EL I S A法檢測體系的建立 用羊抗EV71多克隆抗體［加入抗體保護(hù)劑，用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）按1∶4 000稀釋］包被96孔板，100μL／孔，4℃孵育過夜；用洗滌液（含0.05%Tween 20的0.01 mol／L PBS）洗滌3次，加入封閉液（含1.5%BSA的0.01 mol／L PBS），200μL／孔，37℃封閉1.5 h；用洗滌液洗滌3次，加入標(biāo)準(zhǔn)品（80 U／mL起進(jìn)行倍比稀釋，共8個稀釋度）或待檢樣品（樣品1~5分別從1∶4、1∶6、1∶40、1∶10、1∶4起進(jìn)行倍比稀釋，共7個稀釋度），100μL／孔，37℃孵育2 h；用洗滌液洗滌5次，加入兔抗EV71多克隆抗體（以30%甘油作為保護(hù)劑，用酶稀釋液按1∶2 000稀釋），100μL／孔，37℃孵育1 h；用洗滌液洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG（用酶稀釋液按1∶5 000稀釋），100μL／孔，37℃孵育0.5 h；用洗滌液洗滌5次，加入顯色液，100μL／孔，37℃孵育10 min；加入50μL 2 mol／L的H2SO4；用酶標(biāo)儀檢測A450和A630值。

1.4 兩種方法保存E V71抗原檢測板穩(wěn)定性的檢測按1.3項方法用羊抗EV71多克隆抗體包被20塊96孔板，封閉，洗滌，即為EV71抗原檢測板。將10塊板棄去洗滌液，置室溫自然干燥后，真空密封包裝，置-25℃保存（干燥保存）；另外10塊板用洗滌液浸泡，封口膜封口后置4℃保存（濕保存）。分別于保存0、20、40、60、90、120、180 d時，兩種方法各取1塊EV71抗原檢測板，按1.3項方法檢測5份樣品。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用兩因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析的方法進(jìn)行檢測，兩因素為保存方法和保存時間。保存方法有兩水平（干燥保存和濕保存），無需進(jìn)行Mauchly的球形度檢驗，直接通過主體內(nèi)效應(yīng)檢驗；保存時間及保存方法與保存時間交互作用有兩水平以上，需進(jìn)行球形度檢驗，若檢驗結(jié)果不對稱，需通過Greenhouse-Geisser法進(jìn)行校正。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法保存E V71抗原檢測板對標(biāo)準(zhǔn)品的檢測干燥保存和濕保存不同時間的EV71抗原檢測板檢測標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果變化幅度較小，見表1和表2。保存180 d后，兩種方法保存的抗原檢測板靈敏度（大于cut off值最高稀釋度對應(yīng)的抗原含量）均在1.25~2.5 U／mL之間，無下降趨勢。

表1 濕保存EV71抗原檢測板檢測標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果（A450-A630）Tab.1 Detection result of standard by EV71 antigen detection plate in wet storage（A450-A630）

表2 干燥保存EV71抗原檢測板檢測標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果（A450-A630）Tab.2 Detection result of standard by EV71 antigen detection plate in dry storage（A450-A630）

2.2 兩種方法保存E V71抗原檢測板的穩(wěn)定性 干燥保存EV71抗原檢測板檢測5份樣品7個時間點均值分別為315.0、299.4、7 795.3、827.6、261.4 U／mL，濕保存檢測結(jié)果均值分別為354.3、347.1、6 766.6、749.7、277.3 U／mL。兩種方法保存的EV71抗原檢測板對每份樣品各時間點的檢測結(jié)果變化幅度較小，均在±2 SD范圍內(nèi)，CV為4.8%~11.5%，均<15%，見表3。表明EV71抗原檢測板兩種保存條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

表3 干燥保存和濕保存EV71抗原檢測板檢測樣品的結(jié)果（U／mL）Tab.3 Detection results of samples by EV71 antigen detection plate in dry and wet storages（U／mL）

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果 保存方法兩水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.930，P=0.390），表明兩種方法無明顯差異。保存時間及交互作用球形度檢驗結(jié)果均不對稱（P<0.01），見表4，通過Greenhouse-Geisser法進(jìn)行校正后，保存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.325），保存方法與保存時間無交互作用（P=0.303），見表5。表明兩種方法保存180 d時，檢測板仍可保持較好的活性。

表4 Mauchly的球形度檢驗Tab.4 Mauchly sphericity test

表5 主體內(nèi)效應(yīng)的檢驗Tab.5 Test for intra subject effect

3 討論

ELISA商品化試劑盒的質(zhì)量關(guān)鍵在于產(chǎn)品的穩(wěn)定性和有效期，為使預(yù)包被的抗原或抗體在較長時間內(nèi)保持活性，同時使包被的檢測板便于保存或運(yùn)輸，常將預(yù)包被的酶標(biāo)板真空干燥后密封保存。隨著保存時間的延長，由于塑料袋的質(zhì)量等問題，難以確保酶標(biāo)板處于真空狀態(tài)，使覆蓋在抗體蛋白表面的穩(wěn)定劑受到空氣中水分的溶解或微生物的污染，6個月（180 d）后檢測相同樣品的吸光度值略微偏低［7］。

蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化的原因較多，如溶液的pH、鹽分、糖分的濃度、微生物的作用、空氣的氧化、加熱等化學(xué)物理因素［8］，為使包被酶標(biāo)板的抗體蛋白活性不變，常加入包被穩(wěn)定劑以保護(hù)抗體分子的活性。有研究證實，海澡糖［9］和聚乙二醇［10］能有效提高預(yù)包被板的穩(wěn)定性。本研究用羊抗EV71多克隆抗體包被酶標(biāo)板，未加入包被穩(wěn)定劑，保存180 d后穩(wěn)定性較好，可能與加入抗體穩(wěn)定劑有關(guān)。

ANASRI等［11］研究發(fā)現(xiàn)，固定化抗體在硫酸銨-Tris鹽緩沖液中能夠于6℃保存95 d；于室溫、40℃保存53 d仍能保持良好活性；空氣干燥保存會使抗體迅速失活。本研究將包被的檢測板分別進(jìn)行空氣干燥后真空保存及濕保存，兩種方法保存的EV71抗原檢測板對每份樣品各時間點的檢測結(jié)果變化較小，均在±2 SD范圍內(nèi)，CV均<15%，表明兩種方法保存的EV71抗原檢測板均具有良好的穩(wěn)定性?？贵w的不穩(wěn)定可導(dǎo)致檢測試劑盒試劑不穩(wěn)定［12］，PIKAL等［13］用抗體穩(wěn)定劑中的多糖替代了抗體干燥過程中損失的水分，從而維持抗體的穩(wěn)定性。CHANG等［14］研究證實，抗體固定后能夠獲得特定的穩(wěn)定性，也有研究證實，低溫可確?？贵w的活性，抗體保存溫度越低，活性越好［15］。本研究中兩種檢測板均能獲得良好穩(wěn)定性的原因可能是由于抗體中加入了抗體保護(hù)劑，其中成分對抗體具有一定保護(hù)作用，同時保濕、低溫和抗體固定化也具有一定的作用。

ELISA抗原含量定量檢測是疫苗工藝優(yōu)化、質(zhì)量一致性的重要保證［6］，本研究采用兩種方法保存的EV71抗原檢測板檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），干燥保存法便于運(yùn)輸；濕保存法介于預(yù)包板和現(xiàn)包板之間，可省去真空包裝過程及反復(fù)包被過程。生產(chǎn)廠家和檢定機(jī)構(gòu)可結(jié)合質(zhì)量檢定中的需求進(jìn)行選擇。