宋瑞卿，蘇杭，張玲，張路明，馬寧寧

沈陽藥科大學(xué)無涯學(xué)院，遼寧沈陽110016

單克隆抗體（簡(jiǎn)稱單抗）廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療領(lǐng)域，具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于治療性單抗需求量大、表達(dá)量低，優(yōu)化其生產(chǎn)工藝、提高抗體產(chǎn)量顯得尤為迫切，而優(yōu)化流加補(bǔ)料培養(yǎng)工藝是提高抗體產(chǎn)量的重要途徑。

研究表明，CHO工程細(xì)胞株培養(yǎng)過程中添加丁酸鹽可提高抗體產(chǎn)量［1-3］，但丁酸鹽會(huì)誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、降低細(xì)胞活性［3-5］。丙戊酸鹽是丁酸鹽的類似物，有研究表明［6-11］，在提高抗體產(chǎn)量方面，丙戊酸鈉比丁酸鈉具有明顯優(yōu)勢(shì)，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)仍有負(fù)面影響。氨基酸類、維生素類、金屬離子、4-氨基苯甲酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量提高具有一定的促進(jìn)作用，細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加這些物質(zhì)可減弱丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是細(xì)胞生命活動(dòng)重要的氮源，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，往往通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中不同氨基酸含量，來滿足細(xì)胞生長(zhǎng)過程對(duì)氨基酸的偏好［12-13］。金屬離子如二價(jià)鋅、鐵、銅是維持細(xì)胞生長(zhǎng)和生理活性的重要物質(zhì)，在細(xì)胞合成與代謝過程中發(fā)揮重要作用，其中鋅離子作為細(xì)胞培養(yǎng)過程中重要的微量元素，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝酶的活性，影響細(xì)胞分裂增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理生化過程［14］。在動(dòng)物細(xì)胞無蛋白懸浮培養(yǎng)過程中，可通過加入鋅離子替代胰島素［15］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，鋅離子還具有提高細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，減緩細(xì)胞凋亡，提高抗體產(chǎn)量的作用［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)貝伐珠單抗的CHO工程細(xì)胞株為研究對(duì)象，考察流加補(bǔ)料培養(yǎng)工藝中丙戊酸鈉對(duì)抗體產(chǎn)量的影響，并對(duì)氨基酸類、維生素類、金屬離子等進(jìn)行初步篩選，再通過單因素試驗(yàn)確定鋅離子的最佳濃度，并采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）法對(duì)丙戊酸鈉、鋅離子的組合使用進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 表達(dá)貝伐珠單抗的CHO工程細(xì)胞株由沈陽藥科大學(xué)本溪實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及儀器 CD-CHOK1培養(yǎng)基和CHO NF603補(bǔ)料液購自壹生科（深圳）有限公司；ELISA試劑盒購自英國Bethyl Laboratories公司；蛋氨酸亞氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）、葡萄糖、臺(tái)盼藍(lán)、硫酸鋅、丙戊酸鈉、酪氨酸、支鏈氨基酸、精氨酸、維生素B6、維生素C、硫酸銅和檸檬酸鐵均購自美國Sigma-Aldrich公司；Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀購自奧地利TECAN公司；MilliQ純水器購自美國Miliipore公司。

1.3 流加補(bǔ)料培養(yǎng) 將CHO工程細(xì)胞株復(fù)蘇傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，按0.5×106個(gè)／mL的密度接種至100 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為20 mL，置37℃，8%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r／min。培養(yǎng)3 d后，用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率，并進(jìn)行流加補(bǔ)料培養(yǎng)，補(bǔ)料條件為：CHO NF603補(bǔ)料液3%／24 h；葡萄糖：2 g／（L·24 h）。培養(yǎng)至第13天，取培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測(cè)上清中抗體產(chǎn)量。

1.4 丙戊酸鈉對(duì)C H O工程細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量影響的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第8天開始添加不同濃度的丙戊酸鈉（0、1、1.5、2、2.5 mmol／L），以0 mmol／L丙戊酸鈉組作為對(duì)照組，按1.3項(xiàng)方法檢測(cè)活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率和抗體產(chǎn)量。

1.5 流加物質(zhì)對(duì)C H O工程細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量影響的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第3天開始，每24 h分別添加氨基酸類、維生素類、金屬離子、4-氨基苯甲酸，以未加上述物質(zhì)作為對(duì)照組，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和抗體產(chǎn)量。

1.6 鋅離子濃度的篩選 細(xì)胞培養(yǎng)第3天開始，每24 h添加不同終濃度的鋅離子（0、45、90、135、180μmol／L），以0μmol／L鋅離子組作為對(duì)照組，檢測(cè)活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率和抗體產(chǎn)量。

1.7 兩因素交互作用考察 為了進(jìn)一步考察丙戊酸鈉、鋅離子同時(shí)加入對(duì)抗體產(chǎn)量的影響，利用Minitab 17軟件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)功能對(duì)工藝進(jìn)一步優(yōu)化。通過1.4和1.6項(xiàng)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，丙戊酸鈉終濃度在1.0～2.5 mmol／L范圍內(nèi)、流加物鋅離子終濃度在45～135μmol／L范圍內(nèi)對(duì)抗體產(chǎn)量有較大影響，采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)尋找其最優(yōu)參數(shù)，從而提高抗體產(chǎn)量。將丙戊酸鈉終濃度和鋅離子終濃度2個(gè)因子分別編碼為X1、X2，響應(yīng)值為抗體產(chǎn)量Y。在2個(gè)因素的情況下，應(yīng)取α=1.414，則星號(hào)臂長(zhǎng)為1.414，每個(gè)因子的低、中、高水平分別記作-1、0、1，軸向延伸點(diǎn)分別記作-1.414、+1.414，為使設(shè)計(jì)結(jié)果和推測(cè)出的最佳點(diǎn)均較可信，決定在中心點(diǎn)處進(jìn)行5次試驗(yàn)，則試驗(yàn)次數(shù)為13。各自變量水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表1 中心復(fù)合設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.2 Experimental design of central composite design

借助Minitab 17軟件中的回歸擬合，為響應(yīng)值擬合單獨(dú)的模型，得到響應(yīng)值與自變量的回歸方程，方程中的自變量使用編碼制數(shù)值，二次多項(xiàng)式模型與數(shù)據(jù)的擬合程度用系數(shù)R2表示。利用Minitab 17軟件中響應(yīng)曲面的相關(guān)分析得到響應(yīng)曲面圖和等值線圖，圖中兩個(gè)因子對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)軸均為編碼制數(shù)值。利用Minitab 17軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器獲得最優(yōu)值，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)目標(biāo)為最大化，權(quán)重和重要度均為1。

1.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證模型對(duì)這兩個(gè)因子的優(yōu)化效果，根據(jù)上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的因子最優(yōu)水平值進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丙戊酸鈉對(duì)C H O工程細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度丙戊酸鈉組活細(xì)胞密度及細(xì)胞活率較對(duì)照組均有不同程度降低，見圖1；抗體產(chǎn)量均高于對(duì)照組，其中丙戊酸鈉終濃度為1.5 mmol／L時(shí)，抗體產(chǎn)量最高，為（2 115.2±113.6）mg／L，比對(duì)照組提高了（81.5±9.7）%，見圖2。表明丙戊酸鈉對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，可能限制其提高抗體產(chǎn)量的潛力。

圖1 不同濃度丙戊酸鈉對(duì)CHO工程細(xì)胞活細(xì)胞密度（A）及細(xì)胞活率（B）的影響Fig.1 Effect of sodium valproate at various concentrations on density（A）and survival rate（B）of engineered CHOcells

圖2 不同濃度丙戊酸鈉對(duì)CHO工程細(xì)胞抗體產(chǎn)量（A）及產(chǎn)量增長(zhǎng)百分比（B）的影響Fig.2 Effect of sodium valproate at various concentrations on production（A）and increasing percentage（B）of antibody in engineered CHO cells

2.2 流加物質(zhì)對(duì)C H O工程細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，鋅離子對(duì)促進(jìn)CHO工程細(xì)胞生長(zhǎng)及提高抗體產(chǎn)量的作用較顯著，見表3。

表3 流加物質(zhì)的初步篩選結(jié)果Tab.3 Preliminary screening of additives for fed batch

2.3 鋅離子濃度的篩選 試驗(yàn)結(jié)果顯示，各濃度鋅離子組CHO工程細(xì)胞的最高活細(xì)胞密度均高于對(duì)照組，其中鋅離子終濃度為90μmol／L時(shí)，最高活細(xì)胞密度最大，見圖3。各濃度鋅離子組CHO工程細(xì)胞的抗體產(chǎn)量均高于對(duì)照組，其中鋅離子終濃度為90μmol／L時(shí)，抗體產(chǎn)量最高，為（1 640.2±93.1）mg／L，比對(duì)照組提高了（38.3±4.3）%，見圖4。

圖3 不同終濃度鋅離子對(duì)CHO工程細(xì)胞活細(xì)胞密度（A）及細(xì)胞活率（B）的影響Fig.3 Effect of zinc ion at various concentrations on density（A）and survival rate（B）of engineered CHOcells

圖4 不同終濃度鋅離子對(duì)CHO工程細(xì)胞抗體產(chǎn)量（A）及產(chǎn)量增長(zhǎng)百分比（B）的影響Fig.4 Effect of zinc ion at various concentrations on production（A）and increasing percentage（B）of antibody in engineered CHO cells

2.4 兩因素交互作用考察

中心復(fù)合設(shè)計(jì)13次試驗(yàn)抗體產(chǎn)量分別為2 697、2 667、2 302、2 258、2 701、2 534、2 705、1 915、2 141、2 395、2 292、2 144和2 676 mg／L。

2.4.1 回歸擬合分析 響應(yīng)值與自變量的回歸方程為：Y=2 689.2+87.5 X1+34.7 X2-295.4 X12-146.2 X22+100.0 X1X2，R2=0.949。表明二次多項(xiàng)式回歸效果較好，此模型近似地?cái)M合于真實(shí)情況，且預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性。

2.4.2響應(yīng)曲面圖和等值線圖 響應(yīng)曲面圖見圖5，等值線圖見圖6。由兩圖可以看出，在所考察兩因子的水平范圍內(nèi)，響應(yīng)值（抗體產(chǎn)量）存在最大值，同時(shí)響應(yīng)值與丙戊酸鈉、鋅離子終濃度存在顯著相關(guān)性，且丙戊酸鈉和鋅離子之間的交互作用也較明顯。

圖5 抗體產(chǎn)量響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plot of antibody production

圖6 抗體產(chǎn)量等值線圖Fig.6 Contour plot of antibody production

2.4.3 求取最優(yōu)值 分析可得，當(dāng)編碼制X1=0.1857，X2=0.185 7時(shí)，多項(xiàng)式回歸方程取得最大值，對(duì)應(yīng)的未編碼的實(shí)際值為X1=1.1mmol／L，X2=98.4μmol／L，此時(shí)響應(yīng)值最大，為Ymax=2 700.1 mg／L。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在利用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到兩個(gè)因子最優(yōu)水平的條件下，重復(fù)5次試驗(yàn)所得的抗體產(chǎn)量（Y）與模型擬合所得最大抗體產(chǎn)量的相對(duì)誤差均小于2.0%，平均相對(duì)誤差為0.46%，見表4，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常相近，且試驗(yàn)穩(wěn)定性較好，具有可重復(fù)性。5個(gè)批次的抗體平均產(chǎn)量為2 687.2 mg／L，但在只加入丙戊酸鈉時(shí)，抗體產(chǎn)量最高為2115.2mg／L，相比之下，抗體產(chǎn)量提高了27.0%；在只加入鋅離子時(shí)，抗體產(chǎn)量最高為1 640.2 mg／L，相比之下，抗體產(chǎn)量提高了63.8%，表明丙戊酸鈉和鋅離子同時(shí)加入可進(jìn)一步提高抗體產(chǎn)量。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Result of verification test

3 討論

本研究考察了CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)過程中丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞株抗體產(chǎn)量的影響。丙戊酸鈉流加試驗(yàn)表明，細(xì)胞培養(yǎng)第8天單次添加終濃度為1.5 mmol／L的丙戊酸鈉對(duì)抗體產(chǎn)量提高作用最為明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道，丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞也有一定的毒副作用［14］，因此選擇活細(xì)胞總數(shù)開始下降的時(shí)間點(diǎn)加入丙戊酸鈉，避免過早抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，影響抗體產(chǎn)量。為降低丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的不良影響，嘗試通過流加氨基酸類、維生素類、金屬離子類等物質(zhì)彌補(bǔ)丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)帶來的負(fù)面作用，這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體產(chǎn)量提高具有一定的促進(jìn)作用。通過對(duì)流加物質(zhì)初步篩選得出，鋅離子可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且對(duì)提高抗體產(chǎn)量作用較明顯。鋅離子流加試驗(yàn)表明，細(xì)胞培養(yǎng)第3天開始，每24 h添加鋅離子，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，當(dāng)添加的鋅離子終濃度為90μmol／L時(shí)，對(duì)抗體產(chǎn)量的提高作用最為明顯，表明鋅離子可增加CHO工程細(xì)胞株的抗體產(chǎn)量。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究丙戊酸鈉、鋅離子組合使用對(duì)CHO工程細(xì)胞抗體產(chǎn)量的影響。采用Minitab 17軟件，通過中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到這兩個(gè)因子的最優(yōu)水平，并對(duì)最優(yōu)水平值X1=1.1 mmol／L，X2=98.4μmol／L進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)所得的抗體產(chǎn)量（Y）與模型擬合所得最大抗體產(chǎn)量的相對(duì)誤差均小于2.0%，平均相對(duì)誤差為0.46%，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值非常相近，且試驗(yàn)穩(wěn)定性較好，具有可重復(fù)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，組合使用丙戊酸鈉、鋅離子對(duì)抗體產(chǎn)量提高的比例明顯優(yōu)于單獨(dú)使用，可能是丙戊酸鈉促進(jìn)抗體表達(dá)的同時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，限制其提高抗體產(chǎn)量的潛力，鋅離子的加入可減弱丙戊酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，組合使用可更高效地表達(dá)抗體。