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        牛m i R-504靶基因?qū)δ膛H榉垦渍{(diào)控機(jī)制的預(yù)測(cè)分析

        2021-07-20 09:43:56潘翠麗汪書(shū)哲王興平羅仍卓么魏大為蔡小艷馬云
        關(guān)鍵詞:乳房靶向奶牛

        潘翠麗,汪書(shū)哲,王興平,羅仍卓么,魏大為,蔡小艷,馬云

        寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系,寧夏銀川750021

        miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為22~24 nt的非編碼RNA,通過(guò)與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。有研究表明,miR-504通過(guò)靶向不同的基因影響眾多組織和細(xì)胞的增殖和遷移,從而調(diào)控多種癌癥的發(fā)生,如miR-504通過(guò)靶向FOXP1抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[1];但在口腔癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),miR-504靶向FOXP1可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[2]。多項(xiàng)研究均表明,F(xiàn)OXP1作為調(diào)控癌癥的重要基因之一,在白血病、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、食管癌等疾病中發(fā)揮重要作用[3-7]。另有研究表明,miR-504靶向LOXL2抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖和侵襲[8];LOXL2可能通過(guò)Wnt-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡[9];miR-504靶向CHD1L通過(guò)PI3K/Akt/MMP信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲[10];靶向FZD7通過(guò)Wnt-β-catenin信號(hào)通路抑制惡性膠質(zhì)瘤[11];靶向CDK6抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲[12];靶向TP53INP1抑制惡性骨瘤細(xì)胞增殖和侵襲[13];靶向c-FLIP降低細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞增殖和遷移,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和自噬的發(fā)生[14]。上述研究均表明,miR-504在人類(lèi)免疫和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但目前miR-504對(duì)奶牛乳房炎的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。

        奶牛乳房炎是由細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物引起的一種最常見(jiàn)的奶牛疾病之一[15-16],可導(dǎo)致乳汁質(zhì)量降低、產(chǎn)奶量下降、生產(chǎn)性能喪失等問(wèn)題,給養(yǎng)殖戶(hù)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[17-18]。我國(guó)奶牛乳房炎的發(fā)病率一直居高不下,是奶牛養(yǎng)殖業(yè)重點(diǎn)防范疾病之一。雖然抗生素的使用對(duì)奶牛乳房炎的治療效果較好,但常導(dǎo)致產(chǎn)奶量大幅下降,長(zhǎng)期使用還會(huì)使微生物產(chǎn)生抗性,引發(fā)奶牛的蜂窩組織炎[19];另外,還可導(dǎo)致抗生素在奶牛體內(nèi)殘留,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。miR-504在不同細(xì)胞類(lèi)型和生理狀態(tài)下,通過(guò)調(diào)控不同或相同的靶基因和信號(hào)通路在與免疫相關(guān)的多種疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用,推測(cè)miR-504可能在奶牛乳房炎的發(fā)生和調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù),對(duì)牛miR-504(bta-miR-504)的候選靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)合在線(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)其靶基因進(jìn)行GO分類(lèi)統(tǒng)計(jì)注釋分析和KEGG信號(hào)通路注釋分析,通過(guò)繪制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析靶基因間的蛋白互作關(guān)系,以期為miR-504參與奶牛乳房炎調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 m i R-504序列保守性分析 利用miRBASE(http://www.mirbase.org)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miR-504在不同物種中的成熟序列并進(jìn)行比對(duì),分析其在不同物種間的保守性。

        1.2 b ta-m i R-504靶基因預(yù)測(cè)及篩選 應(yīng)用Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)在線(xiàn)軟件進(jìn)行bta-miR-504靶基因預(yù)測(cè),應(yīng)用R包VennDiagram取2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為后續(xù)分析對(duì)象。

        1.3 b ta-m i R-504候選靶基因的功能注釋及分類(lèi)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線(xiàn)分析工具對(duì)靶基因進(jìn)行GO分類(lèi)統(tǒng)計(jì)注釋分析和KEGG通路注釋分析,應(yīng)用R包作圖。

        1.4 b ta-m i R-504候選靶基因的蛋白質(zhì)互作分析應(yīng)用STRING(https://string-db.org/)功能性蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)在線(xiàn)分析軟件和Cytoscape軟件對(duì)候選靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。

        1.5 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析 將候選靶基因與KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果進(jìn)行重疊分析,并輸入Cytoscape軟件,進(jìn)行bta-miR-504的互作候選靶基因參與主要的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)的繪制。將蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果輸入Cytoscape,應(yīng)用cytohubba中的MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、Bottle-Neck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness和Stress共計(jì)11種算法計(jì)算高置信度條件下的100個(gè)存在互作關(guān)系蛋白的分值,用以評(píng)價(jià)各蛋白在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要性,通過(guò)取交集選取11個(gè)算法中評(píng)分均位于前30%的互作蛋白,作為候選靶基因中的核心基因。

        2 結(jié)果

        2.1 m i R-504序列保守性分析 miR-504成熟區(qū)序列在不同物種間呈高度保守,見(jiàn)表1。

        表1 不同物種間miR-504序列的保守性Tab.1 Conservation of miR-504 sequences in various species

        2.2 b ta-m i R-504靶基因預(yù)測(cè)及篩選 通過(guò)miRWalk在線(xiàn)預(yù)測(cè),共獲得1 715個(gè)候選靶基因;通過(guò)Targetscan在線(xiàn)預(yù)測(cè),共獲得2982個(gè)候選靶基因。2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果交集中共獲得477個(gè)候選靶基因,將其作為后續(xù)研究對(duì)象。

        2.3 b ta-m i R-504候選靶基因的G O注釋及分類(lèi)統(tǒng)計(jì)bta-miR-504候選靶基因參與的主要生物過(guò)程包括細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和負(fù)調(diào)控MAPK活性等,主要參與神經(jīng)元投射、胞質(zhì)囊泡膜和細(xì)胞內(nèi)部組成等細(xì)胞組分,主要分子功能是鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性(序列特異性DNA序列綁定)和金屬離子結(jié)合等。見(jiàn)圖1。

        圖1 bta-miR-504候選靶基因的GO注釋及分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig.1 GOannotation and classification statistics of candidate bta-miR-504 target genes

        2.4 b ta-m i R-504候選靶基因K EGG通路富集分析bta-miR-504候選靶基因顯著富集于非小細(xì)胞肺癌、AMPK、Ras和內(nèi)吞等與炎癥類(lèi)疾病發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路,見(jiàn)圖2。包含靶基因最多的前5個(gè)信號(hào)通路分別為癌癥、內(nèi)吞、Ras、雌激素和胰島素信號(hào)通路;參與信號(hào)通路超過(guò)5個(gè)的靶基因分別為PIK3R1、PRKACB、PDPK1、ATP1A2、ATP1B4、CREB3L2、CREB5、EGFR、TRAF6和SHC3。見(jiàn)圖3。

        圖2 bta-miR-504候選靶基因KEGG通路富集分析Fig.2 KEGGpathway enrichment analysis of candidate btamiR-504 target genes

        圖3 bta-miR-504候選靶基因KEGG通路富集可視化結(jié)果Fig.3 KEGG pathway enrichment visualization of candidate bta-miR-504 target genes

        2.5 b ta-m i R-504候選靶基因的蛋白質(zhì)互作分析預(yù)測(cè)獲得的477個(gè)候選靶基因中,在中等置信度條件下(互作分?jǐn)?shù)>0.4)有近400個(gè)候選靶基因編碼的蛋白質(zhì)存在互作關(guān)系;在高置信度條件下(互作分?jǐn)?shù)>0.7)有100個(gè)候選靶基因編碼的蛋白質(zhì)存在互作關(guān)系。選擇高置信度條件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,其中存在較多互作關(guān)系(互作蛋白數(shù)>10)的蛋白包括TOLLIP、RIK3R1、TRAF6、EGFR、FBXL20、FBXL18、FBXO41、FBXL12等。見(jiàn)圖4。這些蛋白間不僅存在廣泛的互作,且其編碼基因參與癌癥、催乳激素、雌性激素、胰島素、NF-kappa B、AMPK、Ras、TNF及心肌細(xì)胞腎上腺激素等信號(hào)通路,見(jiàn)表2。

        圖4 bta-MiR-504候選靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein interaction network of candidate bta-miR-504 target genes

        表2 bta-miR-504候選靶基因參與的主要信號(hào)通路Tab.2 Main signaling pathways of candidate bta-miR-504 target genes

        2.6 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析 將互作較多(互作蛋白數(shù)>5)的蛋白與其編碼基因參與的KEGG信號(hào)通路進(jìn)行重疊分析發(fā)現(xiàn),TOLLIP、EGFR、PIK3R1、PPKACB、TRAF6、LPAR2、IL1R1、CBL、GAB2、S1PR2、PYGB、CX3CL1、CFTR在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于較核心地位。蛋白互作和編碼基因參與信號(hào)通路均較多的候選靶基因?yàn)镻IK3R1和EGFR,其中PIK3R1主要參與Ras、AMPK、雌激素、胰島素、甲狀腺激素、催乳素、Toll樣受體、丙型肝炎等信號(hào)通路,EGFR主要參與癌癥、內(nèi)吞、Ras、雌激素、丙型肝炎、非小細(xì)胞肺癌和背腹軸形成等信號(hào)通路。見(jiàn)圖5。

        圖5 bta-miR-504候選靶基因參與主要的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 KEGG pathway network of candidate bta-miR-504 target genes

        2.7 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因分析 TRAF6和CFTR在11種算法中均位于前30%,見(jiàn)圖6。因此將二者確定為候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因,參與AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信號(hào)通路調(diào)控。

        圖6 bta-miR-504的核心候選靶基因Fig.6 Candidate core target genes of bta-miR-504

        3 討論

        有文獻(xiàn)表明,miR-504在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、口腔癌、白血病、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、食管癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-14],推測(cè)miR-504可調(diào)控奶牛乳房炎等免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展,但尚無(wú)miR-504參與奶牛乳房炎調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。同時(shí),miR-504預(yù)測(cè)的靶基因數(shù)量龐大,涉及的信號(hào)通路眾多,探討各靶基因和信號(hào)通路間的關(guān)系需耗費(fèi)大量人力和財(cái)力。本研究通過(guò)比對(duì)不同物種miR-504成熟序列的同源性,發(fā)現(xiàn)物種間存在高度保守性,推測(cè)miR-504在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。通過(guò)DAVID軟件對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因集合進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析,發(fā)現(xiàn)這些靶基因在生物學(xué)過(guò)程層面上顯著富集細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和負(fù)調(diào)控MAPK活性等條目。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn),靶基因主要顯著富集在與Ras、AMPK和內(nèi)吞作用等免疫過(guò)程相關(guān)通路中,這與在人類(lèi)的研究結(jié)果相似[2-14],證明靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

        本研究通過(guò)對(duì)miR-504靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析確定了TRAF6和CFTR 2個(gè)核心靶基因,TRAF6作為一個(gè)內(nèi)源免疫應(yīng)答基因在人類(lèi)前列腺癌[20]、惡性膠質(zhì)瘤[21]、結(jié)腸癌[22-23]、口腔癌[24]等疾病的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中,姜黃素通過(guò)抑制TLR2介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路下調(diào)TRAF6、TNF-α、IL-6、IL-1β和MEKK1的表達(dá)改善葡萄球菌引起的乳腺炎[24]。在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,miR-146a通過(guò)靶向TRAF6抑制NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子抑制乳房炎的發(fā)生[25]。TLR作為牛乳腺上皮細(xì)胞的重要受體能夠啟動(dòng)天然免疫反應(yīng),通過(guò)LPS-TLR4信號(hào)通路下調(diào)炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及下游信號(hào)分子TRAF6、IRAK1、IRAK4的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[26]。CFTR是一種重要的氯離子通道蛋白,控制氯離子的跨膜流動(dòng)以維持細(xì)胞的正常功能,CFTR的突變通常會(huì)引起囊性纖維化病變[27-29]。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn),CFTR參與AMPK和醛固酮調(diào)節(jié)的離子重吸收信號(hào)通路,TRAF6參與Ras、Hepatitis C和Measles信號(hào)通路,這些信號(hào)通路均與免疫過(guò)程相關(guān),推測(cè)miR-504通過(guò)靶向TRAF6和CFTR等關(guān)鍵基因參與奶牛乳房炎等免疫相關(guān)疾病的調(diào)控。

        綜上所述,bta-miR-504的成熟區(qū)序列在物種間高度保守,其核心候選靶基因TRAF6和CFTR可能通過(guò)AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信號(hào)通路參與免疫過(guò)程的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)為miR-504在奶牛乳房炎等疾病調(diào)控中作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

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