潘翠麗，汪書哲，王興平，羅仍卓么，魏大為，蔡小艷，馬云

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，寧夏銀川750021

miRNA是一類長度為22~24 nt的非編碼RNA，通過與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。有研究表明，miR-504通過靶向不同的基因影響眾多組織和細(xì)胞的增殖和遷移，從而調(diào)控多種癌癥的發(fā)生，如miR-504通過靶向FOXP1抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［1］；但在口腔癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-504靶向FOXP1可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲［2］。多項(xiàng)研究均表明，F(xiàn)OXP1作為調(diào)控癌癥的重要基因之一，在白血病、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、食管癌等疾病中發(fā)揮重要作用［3-7］。另有研究表明，miR-504靶向LOXL2抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖和侵襲［8］；LOXL2可能通過Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡［9］；miR-504靶向CHD1L通過PI3K／Akt／MMP信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲［10］；靶向FZD7通過Wnt-β-catenin信號通路抑制惡性膠質(zhì)瘤［11］；靶向CDK6抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲［12］；靶向TP53INP1抑制惡性骨瘤細(xì)胞增殖和侵襲［13］；靶向c-FLIP降低細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和自噬的發(fā)生［14］。上述研究均表明，miR-504在人類免疫和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但目前miR-504對奶牛乳房炎的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。

奶牛乳房炎是由細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物引起的一種最常見的奶牛疾病之一［15-16］，可導(dǎo)致乳汁質(zhì)量降低、產(chǎn)奶量下降、生產(chǎn)性能喪失等問題，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［17-18］。我國奶牛乳房炎的發(fā)病率一直居高不下，是奶牛養(yǎng)殖業(yè)重點(diǎn)防范疾病之一。雖然抗生素的使用對奶牛乳房炎的治療效果較好，但常導(dǎo)致產(chǎn)奶量大幅下降，長期使用還會使微生物產(chǎn)生抗性，引發(fā)奶牛的蜂窩組織炎［19］；另外，還可導(dǎo)致抗生素在奶牛體內(nèi)殘留，嚴(yán)重威脅人類健康。miR-504在不同細(xì)胞類型和生理狀態(tài)下，通過調(diào)控不同或相同的靶基因和信號通路在與免疫相關(guān)的多種疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用，推測miR-504可能在奶牛乳房炎的發(fā)生和調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究通過生物信息學(xué)分析技術(shù)，對牛miR-504（bta-miR-504）的候選靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合在線預(yù)測結(jié)果對其靶基因進(jìn)行GO分類統(tǒng)計(jì)注釋分析和KEGG信號通路注釋分析，通過繪制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析靶基因間的蛋白互作關(guān)系，以期為miR-504參與奶牛乳房炎調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 m i R-504序列保守性分析 利用miRBASE（http：／／www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫檢索miR-504在不同物種中的成熟序列并進(jìn)行比對，分析其在不同物種間的保守性。

1.2 b ta-m i R-504靶基因預(yù)測及篩選 應(yīng)用Targetscan（http：／／www.targetscan.org／vert_72／）和miRWalk（http：／／mirwalk.umm.uni-heidelberg.de／）在線軟件進(jìn)行bta-miR-504靶基因預(yù)測，應(yīng)用R包VennDiagram取2個(gè)預(yù)測結(jié)果的交集作為后續(xù)分析對象。

1.3 b ta-m i R-504候選靶基因的功能注釋及分類統(tǒng)計(jì)應(yīng)用DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／）在線分析工具對靶基因進(jìn)行GO分類統(tǒng)計(jì)注釋分析和KEGG通路注釋分析，應(yīng)用R包作圖。

1.4 b ta-m i R-504候選靶基因的蛋白質(zhì)互作分析應(yīng)用STRING（https：／／string-db.org／）功能性蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件和Cytoscape軟件對候選靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。

1.5 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析 將候選靶基因與KEGG信號通路分析結(jié)果進(jìn)行重疊分析，并輸入Cytoscape軟件，進(jìn)行bta-miR-504的互作候選靶基因參與主要的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)的繪制。將蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果輸入Cytoscape，應(yīng)用cytohubba中的MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、Bottle-Neck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness和Stress共計(jì)11種算法計(jì)算高置信度條件下的100個(gè)存在互作關(guān)系蛋白的分值，用以評價(jià)各蛋白在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要性，通過取交集選取11個(gè)算法中評分均位于前30%的互作蛋白，作為候選靶基因中的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 m i R-504序列保守性分析 miR-504成熟區(qū)序列在不同物種間呈高度保守，見表1。

表1 不同物種間miR-504序列的保守性Tab.1 Conservation of miR-504 sequences in various species

2.2 b ta-m i R-504靶基因預(yù)測及篩選 通過miRWalk在線預(yù)測，共獲得1 715個(gè)候選靶基因；通過Targetscan在線預(yù)測，共獲得2982個(gè)候選靶基因。2個(gè)預(yù)測結(jié)果交集中共獲得477個(gè)候選靶基因，將其作為后續(xù)研究對象。

2.3 b ta-m i R-504候選靶基因的G O注釋及分類統(tǒng)計(jì)bta-miR-504候選靶基因參與的主要生物過程包括細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和負(fù)調(diào)控MAPK活性等，主要參與神經(jīng)元投射、胞質(zhì)囊泡膜和細(xì)胞內(nèi)部組成等細(xì)胞組分，主要分子功能是鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性（序列特異性DNA序列綁定）和金屬離子結(jié)合等。見圖1。

圖1 bta-miR-504候選靶基因的GO注釋及分類統(tǒng)計(jì)Fig.1 GOannotation and classification statistics of candidate bta-miR-504 target genes

2.4 b ta-m i R-504候選靶基因K EGG通路富集分析bta-miR-504候選靶基因顯著富集于非小細(xì)胞肺癌、AMPK、Ras和內(nèi)吞等與炎癥類疾病發(fā)生相關(guān)的信號通路，見圖2。包含靶基因最多的前5個(gè)信號通路分別為癌癥、內(nèi)吞、Ras、雌激素和胰島素信號通路；參與信號通路超過5個(gè)的靶基因分別為PIK3R1、PRKACB、PDPK1、ATP1A2、ATP1B4、CREB3L2、CREB5、EGFR、TRAF6和SHC3。見圖3。

圖2 bta-miR-504候選靶基因KEGG通路富集分析Fig.2 KEGGpathway enrichment analysis of candidate btamiR-504 target genes

圖3 bta-miR-504候選靶基因KEGG通路富集可視化結(jié)果Fig.3 KEGG pathway enrichment visualization of candidate bta-miR-504 target genes

2.5 b ta-m i R-504候選靶基因的蛋白質(zhì)互作分析預(yù)測獲得的477個(gè)候選靶基因中，在中等置信度條件下（互作分?jǐn)?shù)>0.4）有近400個(gè)候選靶基因編碼的蛋白質(zhì)存在互作關(guān)系；在高置信度條件下（互作分?jǐn)?shù)>0.7）有100個(gè)候選靶基因編碼的蛋白質(zhì)存在互作關(guān)系。選擇高置信度條件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，其中存在較多互作關(guān)系（互作蛋白數(shù)>10）的蛋白包括TOLLIP、RIK3R1、TRAF6、EGFR、FBXL20、FBXL18、FBXO41、FBXL12等。見圖4。這些蛋白間不僅存在廣泛的互作，且其編碼基因參與癌癥、催乳激素、雌性激素、胰島素、NF-kappa B、AMPK、Ras、TNF及心肌細(xì)胞腎上腺激素等信號通路，見表2。

圖4 bta-MiR-504候選靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein interaction network of candidate bta-miR-504 target genes

表2 bta-miR-504候選靶基因參與的主要信號通路Tab.2 Main signaling pathways of candidate bta-miR-504 target genes

2.6 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析 將互作較多（互作蛋白數(shù)>5）的蛋白與其編碼基因參與的KEGG信號通路進(jìn)行重疊分析發(fā)現(xiàn)，TOLLIP、EGFR、PIK3R1、PPKACB、TRAF6、LPAR2、IL1R1、CBL、GAB2、S1PR2、PYGB、CX3CL1、CFTR在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于較核心地位。蛋白互作和編碼基因參與信號通路均較多的候選靶基因?yàn)镻IK3R1和EGFR，其中PIK3R1主要參與Ras、AMPK、雌激素、胰島素、甲狀腺激素、催乳素、Toll樣受體、丙型肝炎等信號通路，EGFR主要參與癌癥、內(nèi)吞、Ras、雌激素、丙型肝炎、非小細(xì)胞肺癌和背腹軸形成等信號通路。見圖5。

圖5 bta-miR-504候選靶基因參與主要的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 KEGG pathway network of candidate bta-miR-504 target genes

2.7 b ta-m i R-504候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因分析 TRAF6和CFTR在11種算法中均位于前30%，見圖6。因此將二者確定為候選靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，參與AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信號通路調(diào)控。

圖6 bta-miR-504的核心候選靶基因Fig.6 Candidate core target genes of bta-miR-504

3 討論

有文獻(xiàn)表明，miR-504在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、口腔癌、白血病、卵巢癌、頭頸癌、肺癌、食管癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2-14］，推測miR-504可調(diào)控奶牛乳房炎等免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展，但尚無miR-504參與奶牛乳房炎調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，miR-504預(yù)測的靶基因數(shù)量龐大，涉及的信號通路眾多，探討各靶基因和信號通路間的關(guān)系需耗費(fèi)大量人力和財(cái)力。本研究通過比對不同物種miR-504成熟序列的同源性，發(fā)現(xiàn)物種間存在高度保守性，推測miR-504在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。通過DAVID軟件對預(yù)測的靶基因集合進(jìn)行GO和KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因在生物學(xué)過程層面上顯著富集細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和負(fù)調(diào)控MAPK活性等條目。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因主要顯著富集在與Ras、AMPK和內(nèi)吞作用等免疫過程相關(guān)通路中，這與在人類的研究結(jié)果相似［2-14］，證明靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性。

本研究通過對miR-504靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析確定了TRAF6和CFTR 2個(gè)核心靶基因，TRAF6作為一個(gè)內(nèi)源免疫應(yīng)答基因在人類前列腺癌［20］、惡性膠質(zhì)瘤［21］、結(jié)腸癌［22-23］、口腔癌［24］等疾病的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中，姜黃素通過抑制TLR2介導(dǎo)的NF-κB信號通路下調(diào)TRAF6、TNF-α、IL-6、IL-1β和MEKK1的表達(dá)改善葡萄球菌引起的乳腺炎［24］。在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，miR-146a通過靶向TRAF6抑制NF-κB信號通路調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子抑制乳房炎的發(fā)生［25］。TLR作為牛乳腺上皮細(xì)胞的重要受體能夠啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)，通過LPS-TLR4信號通路下調(diào)炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及下游信號分子TRAF6、IRAK1、IRAK4的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用［26］。CFTR是一種重要的氯離子通道蛋白，控制氯離子的跨膜流動(dòng)以維持細(xì)胞的正常功能，CFTR的突變通常會引起囊性纖維化病變［27-29］。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，CFTR參與AMPK和醛固酮調(diào)節(jié)的離子重吸收信號通路，TRAF6參與Ras、Hepatitis C和Measles信號通路，這些信號通路均與免疫過程相關(guān)，推測miR-504通過靶向TRAF6和CFTR等關(guān)鍵基因參與奶牛乳房炎等免疫相關(guān)疾病的調(diào)控。

綜上所述，bta-miR-504的成熟區(qū)序列在物種間高度保守，其核心候選靶基因TRAF6和CFTR可能通過AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信號通路參與免疫過程的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)為miR-504在奶牛乳房炎等疾病調(diào)控中作用的研究奠定了基礎(chǔ)。