楊勇，吳永超，張飛偉，楊坤，閔憲捷，劉佐軍，雍雪飛，劉少祥，潘海龍

成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都610023

百日咳桿菌經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)、純化、脫毒后，獲得百日咳疫苗原液，用于制備吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗，百日咳毒素（pertussis toxin，PT）和絲狀血凝素（filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）是疫苗中最主要的抗原成分［1-4］。脫毒工藝主要是對(duì)PT進(jìn)行脫毒［5］，若PT含量占比過(guò)高，將導(dǎo)致脫毒不完全；占比過(guò)低，將造成脫毒過(guò)度，影響PT的免疫原性。因此，原液中PT的含量比例直接影響脫毒效果，從而影響成品疫苗的毒性指標(biāo)和效價(jià)。受共純化工藝限制，生產(chǎn)過(guò)程中PT與FHA未進(jìn)行分離，需共同進(jìn)行純化和脫毒，無(wú)法改變單一批次原液中PT和FHA含量配比［1］，因此，需在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行調(diào)控。

百日咳桿菌生長(zhǎng)環(huán)境的改變將影響抗原表達(dá)水平［6-8］，可通過(guò)控制培養(yǎng)參數(shù)調(diào)控抗原的表達(dá)水平。百日咳桿菌為好氧菌［9］，高溶氧水平有利于其生長(zhǎng)，但不利于產(chǎn)毒階段PT的表達(dá)。適當(dāng)提高細(xì)菌生長(zhǎng)階段的溶氧水平，降低產(chǎn)毒階段的溶氧水平，有利于PT的表達(dá)［10］。高剪切力對(duì)FHA有一定破壞力，在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的低溶氧水平下，降低剪切力，適當(dāng)提高產(chǎn)毒階段的溶氧，可使FHA含量處于較高水平。目前，提高溶氧的途徑有改變攪拌轉(zhuǎn)速、擋板、純氧通氣量、罐內(nèi)壓力、攪拌葉片形狀等，可通過(guò)多種控制手段組合實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中的溶氧控制。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)不同的參數(shù)組合方案來(lái)控制溶氧水平，比較發(fā)酵物中PT和FHA的表達(dá)量來(lái)確定最佳方案。

1 材料與方法

1.1 菌種 百日咳桿菌58003（cs）株來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱成都公司）細(xì)菌性疫苗一室保存。

1.2 主要試劑及儀器 百日咳S-S培養(yǎng)基（無(wú)動(dòng)物源性成分）及活性炭半綜合固體培養(yǎng)基由成都公司培養(yǎng)基室提供；PT和FHA抗原含量ELISA檢測(cè)試劑盒、PT和FHA抗原標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自NIBSC；發(fā)酵罐（百日咳50、300 L全自動(dòng)發(fā)酵系統(tǒng)）購(gòu)自成都英德生物工程有限公司；溶氧檢測(cè)電極（Mett1er Tor1edoinpro6830）購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 發(fā)酵種子的制備 將百日咳桿菌接種至活性炭半綜合固體培養(yǎng)基，于36℃培養(yǎng)72 h；按1∶3的比例進(jìn)行傳代，36℃培養(yǎng)48 h；按1∶5的比例繼續(xù)傳代，36℃培養(yǎng)48 h；按1∶30的比例接種于百日咳S-S液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（50 L發(fā)酵罐），于36℃培養(yǎng)32 h，作為發(fā)酵種子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng) 采用300 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行百日咳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基為百日咳S-S培養(yǎng)基，攪拌通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)量200L，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種比例1∶12~1∶15。試驗(yàn)分為3組：高PT表達(dá)組、高FHA表達(dá)組及對(duì)照組，每組平行培養(yǎng)3批培養(yǎng)物，批號(hào)分別為1～3、4～6、7～9。高PT表達(dá)組攪拌轉(zhuǎn)速為160 r／min，攪拌葉片為直葉，有擋板，培養(yǎng)0～20及21～40 h通氣量分別為600和400 L／min；高FHA表達(dá)組攪拌轉(zhuǎn)速為220 r／min，攪拌葉片為彎葉，無(wú)擋板，培養(yǎng)0～20及21～40 h的通氣量分別為400和600 L／min；對(duì)照組攪拌轉(zhuǎn)速為180 r／min，攪拌葉片為直葉，有擋板，培養(yǎng)0～40 h通氣量均為500 L／min。

1.5 生長(zhǎng)曲線的繪制 每批培養(yǎng)物培養(yǎng)過(guò)程中，0～12 h每4 h取1次樣，12 h后每2 h取1次樣，用分光光度計(jì)檢測(cè)A550，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A550為縱坐標(biāo)，繪制培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線。

1.6 溶氧量的檢測(cè) 每批培養(yǎng)物培養(yǎng)過(guò)程中，0～12 h每4 h取1次樣，12 h后每2 h取1次樣，通過(guò)發(fā)酵系統(tǒng)在線溶氧電極檢測(cè)溶氧量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶氧量為縱坐標(biāo)，繪制培養(yǎng)物溶氧曲線。

1.7 P T和FHA含量的檢測(cè) 每批培養(yǎng)結(jié)束后，取樣，3 600×g離心10 min，取上清，采用PT和FHA抗原含量ELISA試劑盒進(jìn)行定量測(cè)定［11-12］。用NIBSC的PT和FHA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)A450和A630進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，計(jì)算PT和FHA含量［13-14］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Excel 2019和Origin 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有效抗原含量的檢測(cè)結(jié)果組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)物的生長(zhǎng)曲線 各組培養(yǎng)物生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，見(jiàn)圖1。表明發(fā)酵參數(shù)的改變未影響百日咳桿菌生長(zhǎng)。

圖1 各批培養(yǎng)物的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of cultures of various batches

2.2 溶氧曲線 培養(yǎng)20 h（產(chǎn)毒期）時(shí)，高PT表達(dá)組溶氧水平大幅下降，高FHA表達(dá)組溶氧水平略微升高，隨后下降。培養(yǎng)22 h時(shí)，高FHA表達(dá)組的溶氧量高于高PT表達(dá)組和對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖2 各批培養(yǎng)物發(fā)酵過(guò)程中溶氧量的變化趨勢(shì)Fig.2 Change trends of DOin cultures of various batches

2.3 P T和FHA含量 高PT表達(dá)組PT含量平均值達(dá)3.16μg／mL，比對(duì)照組（平均值2.23μg／mL）提升了41.7%（t=6.14，P=0.025）；高FHA表達(dá)組FHA含量平均值達(dá)21.37μg／mL，比對(duì)照組（平均值11.00μg／mL）提升了94.3%（t=8.86，P=0.013）。見(jiàn)表1。表明在培養(yǎng)階段，通過(guò)參數(shù)控制，可提高培養(yǎng)物中PT及FHA的表達(dá)量。

表1 各批培養(yǎng)物中PT及FHA的含量（μg／mL）Tab.1 PT and FHA contents in cultures of various batches（μg／mL）

3 討論

共純化工藝生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗中，無(wú)細(xì)胞百日咳組分的生產(chǎn)和脫毒工藝尤為復(fù)雜，生產(chǎn)難度較高，因此，針對(duì)PT和FHA兩個(gè)主要抗原生產(chǎn)工藝的優(yōu)化尤為重要。本研究從發(fā)酵工藝參數(shù)的控制入手，有效提高了百日咳桿菌培養(yǎng)物中單個(gè)組分（PT或FHA）的表達(dá)量（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)控制主要反映在溶氧水平和攪拌剪切力兩方面，影響這兩項(xiàng)指標(biāo)最主要的因素是有無(wú)擋板、攪拌葉片的選擇和通氣量的大小。高PT表達(dá)組安裝有擋板，直葉的攪拌剪切力較大，溶氧水平會(huì)較高，因此在產(chǎn)毒階段適當(dāng)降低通氣量，保持產(chǎn)毒階段［9］的低溶氧水平，利于PT的表達(dá)；較高的剪切力對(duì)FHA有一定破壞，使高PT表達(dá)組的PT含量較高，F(xiàn)HA含量較低。高FHA表達(dá)組雖然提高了通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，但去掉了擋板，攪拌葉片也改為彎葉，目的是適當(dāng)降低剪切力，保護(hù)FHA不被破壞，同時(shí)增大了通氣量，保持產(chǎn)毒階段的高溶氧水平，適當(dāng)限制PT的表達(dá)，使FHA含量比例處于較高水平。上述結(jié)果表明，在百日咳桿菌發(fā)酵工藝中，高攪拌剪切力和較低的溶氧水平有利于PT的表達(dá)，低剪切力和高溶氧水平有利于提高FHA的產(chǎn)量。

綜上所述，本研究通過(guò)控制發(fā)酵參數(shù)，有效提高了PT和FHA的表達(dá)水平，有望用以指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)中獲得理想的PT與FHA占比的百日咳抗原，同時(shí)對(duì)減小批間差異，提高百日咳抗原的脫毒效果和百日咳原液的效價(jià)均具有重要意義。另外，其他的研究方向，如發(fā)酵過(guò)程中酸堿度的控制［10］、培養(yǎng)基成分的優(yōu)化［15-16］、過(guò)程中生長(zhǎng)因子［17］的補(bǔ)加、培養(yǎng)溫度等，也可能對(duì)PT和FHA的表達(dá)水平有較大影響，需步深入研究。