韓秋菊，王晨，陳旺，李薇

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

黃秋葵(Abelmoschusesculentus)，也稱咖啡黃葵，屬錦葵科黃秋葵屬,富含多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多種維生素、黃酮類化合物等，具有很高的開(kāi)發(fā)潛力與開(kāi)發(fā)價(jià)值[1]。黃秋葵多糖具有抗疲勞、抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、抗菌、提高免疫力等藥理作用[2-4]，并已廣泛用于面制品、肉制品、飲料、冰淇淋等食品的生產(chǎn)中。

超聲處理工藝具有提取時(shí)間短、無(wú)腐蝕性溶劑、多糖得率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種綠色、環(huán)保的工藝。本研究?jī)?yōu)化了超聲提取法提取黃秋葵多糖的工藝，并檢測(cè)所得粗多糖的體外抗氧化活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

苯酚、葡萄糖、濃硫酸、無(wú)水乙醇、乙醚、鹽酸、三羥基氨基甲烷、抗壞血酸(VC)、鄰苯三酚、水楊酸鈉、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀均為分析純;黃秋葵,購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

ALC-1100.2電子天平;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī);DUG-9021A電熱恒溫干燥箱;UV-2600可見(jiàn)分光光度計(jì);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋;SHB-II型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 黃秋葵多糖的提取

將黃秋葵的新鮮莢果清洗干凈，于80 ℃烘干至恒重，充分粉碎，過(guò)0.5 mm篩，用80%乙醇溶液在80 ℃回流脫脂6 h，過(guò)濾、干燥，得黃秋葵粉末。稱取黃秋葵粉末，按照一定液料比45∶1 mL/g加蒸餾水，混勻后超聲處理，再水浴浸提2 h，過(guò)濾，濾液加入3倍體積無(wú)水乙醇，離心，得到粗多糖沉淀，乙醚和無(wú)水乙醇交替洗滌3次，陰涼處干燥，得黃秋葵粗多糖樣品。多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[5]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=12.037x+ 0.046 1(R2=0.999 2)。

黃秋葵多糖提取率(%)=粗多糖質(zhì)量(mg)×稀釋倍數(shù)×100/黃秋葵樣品質(zhì)量(mg)

1.3 黃秋葵多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

(1)

1.3.2 對(duì)羥基自由基(·OH)清除效果的測(cè)定 分別取10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、樣品各1 mL，混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min， 加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液終止反應(yīng)，510 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)i。A0為用H2O作空白對(duì)照的空白組吸光值。Ai0為不加H2O2的本底吸光值。清除率計(jì)算根據(jù)公式(2)。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

(2)

1.3.3 總還原力的測(cè)定 取2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液和2 mL樣品，混勻，于50 ℃保溫30 min，加入2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，700 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)i。A0為用H2O作空白對(duì)照的空白組吸光值。總還原力計(jì)算根據(jù)公式(3)。

總還原力=Ai-A0

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察液料比、超聲時(shí)間、提取溫度、超聲功率對(duì)黃秋葵多糖提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)考察黃秋葵多糖的提取條件Fig.1 Single factor experiment to investigate the extraction conditions of Abelmoschus esculentus polysaccharide

由圖1可知，最佳液料比40∶1 mL/g左右，最佳超聲時(shí)間為15 min，最佳提取溫度為60 ℃，最佳超聲功率345 W。

2.2 黃秋葵多糖提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),優(yōu)化提取黃秋葵多糖的工藝條件。因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Box-Behnken test conditions

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken test

黃秋葵多糖提取率與各因素之間的關(guān)系可以表示為以下多元二次回歸方程：

Y=6.24+0.60A+0.32B-0.17C+0.12D

+0.077AB-0.052AC+0.12AD+0.19BC

+0.65BD+0.47CD-0.26A2-0.69B2

-0.45C2-0.58D2

方程方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken test

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 圖2表示任意2個(gè)因素交互作用對(duì)黃秋葵多糖提取率的影響，其余2個(gè)因素取0。交互項(xiàng)DB、CD的響應(yīng)面圖走勢(shì)較陡，影響顯著。此結(jié)果與P值分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)回歸方程和響應(yīng)面圖分析，超聲法提取黃秋葵多糖的最佳工藝條件為：液料比45.12∶1 mL/g，超聲功率394.68 W，提取溫度62.33 ℃， 超聲時(shí)間18.16 min，預(yù)測(cè)最大提取率可達(dá)6.76%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，上述條件修正為：液料比45∶1 mL/g，超聲功率395 W，提取溫度62 ℃，超聲時(shí)間18 min。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，黃秋葵多糖提取率分別為6.89%,6.92%,7.01%，黃秋葵多糖提取率為(6.94±0.062 4)%。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型的可靠性較好。

2.3 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)選取VC為參照。圖3(a，b)為黃秋葵多糖清除超氧陰離子自由基(·O2-)和羥基自由基(·OH)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 黃秋葵多糖體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Antioxidative effect of Abelmoschus esculentus polysaccharide in vitro

由圖3可知,黃秋葵多糖對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除效果均與濃度正相關(guān)，具有較明顯的量效關(guān)系。清除超氧陰離子自由基的IC50值為2 690.8 μg/mL，清除羥基自由基的IC50值為1 999.8 μg/mL。 黃秋葵多糖總還原力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3(c)，由圖可知，黃秋葵多糖對(duì)Fe3+有一定的還原能力，相同濃度下的還原能力低于VC，作用效果與濃度正相關(guān)。總之，黃秋葵多糖具有一定的體外抗氧化能力。

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了超聲法提取黃秋葵多糖的工藝，多糖得率達(dá)到(6.94±0.062 4)%。所得黃秋葵多糖能較好地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，對(duì)Fe3+有較好的還原能力，具有一定的體外抗氧化活性。