諸亞鋒,徐錚

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京,211816)

乳果糖(lactulose)是由D-半乳糖基和D-果糖基通過β-1,4糖苷鍵連接成的二糖,作為一種功能性低聚糖它無法被人體吸收,但可被腸道微生物利用,對(duì)便秘和肝性腦病患者具有較好的療效[1-3],對(duì)濫用抗生素導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)調(diào)節(jié)作用顯著[4],在動(dòng)物飼料中添加乳果糖可以防止鐮刀菌毒素引發(fā)的疾病[5],還可添加到奶酪中作為益生元產(chǎn)品來生產(chǎn)功能性芝士[6]或改善酸奶的口感[7]。因此,乳果糖在醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域都具有廣泛用途,經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大。

當(dāng)前乳果糖的工業(yè)化生產(chǎn)方法為化學(xué)催化法,即乳糖在堿性加熱環(huán)境下會(huì)部分自發(fā)異構(gòu)為乳果糖[8],但該方法僅有不到25%的轉(zhuǎn)化率。加入硼酸或偏鋁酸鹽可與乳果糖形成絡(luò)合物使反應(yīng)平衡向乳果糖生成方向移動(dòng),反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至中性或酸性可解離出絡(luò)合物,可將轉(zhuǎn)化率提升到75%以上[9]。然而去除鋁或硼元素需要大量特種樹脂,工藝成本高昂導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化后利潤率低。因此化學(xué)法雖有周期短、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn),卻存在污染大和提純成本高的缺點(diǎn),限制了應(yīng)用。酶法制備工藝無污染,下游分離方法成熟,有望取代化學(xué)法成為未來生產(chǎn)乳果糖的主要方式。目前可用的2類酶分別為β-半乳糖苷酶和纖維二糖差向異構(gòu)酶(cellobiose 2-epimerase,CE酶),前者產(chǎn)量較低,例在200 g/L底物條件下產(chǎn)量僅為22.6 g/L[10],原因在于該酶具備水解乳果糖的副反應(yīng)特性。GUERRERO等[11]研究了影響β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷和水解的因素,采用分批補(bǔ)料的方式提高了乳果糖產(chǎn)量,但乳果糖最終產(chǎn)率仍不超過45%。與之相比,CE酶僅需單一底物乳糖且轉(zhuǎn)化率高,來源多為嗜熱微生物,熱穩(wěn)定性較好[12]。近年來針對(duì)CE酶的研究已成為熱點(diǎn),例如沈秋云[13]通過對(duì)Caldicellulosiruptorsaccharolyticus來源的CE酶(CSCE)進(jìn)行定向進(jìn)化,使其對(duì)乳果糖的產(chǎn)率大幅提高;CHEN等[14]也通過半理性設(shè)計(jì)改造提高了該酶的異構(gòu)活性和熱穩(wěn)定性。由于嗜熱酶在高溫下熱穩(wěn)定性好,因此純化僅需一步熱處理；本身又耐貯存、高溫催化過程不易染菌,因此嗜熱型CE酶制備乳果糖的技術(shù)更具備應(yīng)用前景。

在已報(bào)道的CE酶中,CSCE純酶酶活力可達(dá)30 U/mg。然而,該酶同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生15%的副產(chǎn)物依匹乳糖(epilactose),遠(yuǎn)高于中國藥典所允許的副產(chǎn)物比例[15]；依匹乳糖的分離難度也很大,因此該工藝存在此瓶頸問題。本文對(duì)嗜熱型CE酶進(jìn)行了挖掘,考慮到嗜熱微生物中含有這類酶的概率更大,在基因庫中檢索發(fā)現(xiàn),超嗜熱微生物網(wǎng)團(tuán)菌屬Dictyoglomussp.菌株NZ13-RE01編碼有CE酶基因,將該基因(簡稱NZ13-CE)在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。純酶性質(zhì)研究表明,其催化溫度較高,所產(chǎn)依匹乳糖含量相對(duì)較低,這表明該酶可能是適合于乳果糖規(guī)模化生產(chǎn)的候選酶。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用試劑

DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒,南京諾唯贊生物科技公司；PCR引物、目的基因DNA片段,安徽通用生物公司；DNA marker、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品marker,Takara(大連)公司；乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品,北京百靈威科技有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)別。

1.2 培養(yǎng)基

LB(種子)培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl,NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L甘油、15 g/L酵母粉、12 g/L胰蛋白胨、2.1 g/L一水合檸檬酸、0.3 g/L檸檬酸鐵銨、2.5 g/L(NH4)2SO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、9.8 g/L K2HPO4·3H2O、15.1 g/L Na2HPO4·12H2O、3 g/L KH2PO4,NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：500 g/L甘油、10 g/L MgSO4·7H2O。

1.3 菌株與載體

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3),南京諾唯贊生物技術(shù)公司,表達(dá)質(zhì)粒載體pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-nz13的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)

NCBI數(shù)據(jù)庫查詢得到NZ13-CE酶的編碼基因序列,根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化后,由安徽通用生物公司合成并連接到表達(dá)載體pET-28a；將適量重組質(zhì)粒加入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中,經(jīng)熱激冰浴后涂布于含25 μg/mL卡納霉素的LB平板中,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR以及DNA測序驗(yàn)證。

2.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)及電泳鑒定

挑取出發(fā)菌株單菌落,接入含25 μg/mL卡那霉素、裝有50 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,37 ℃和220 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8,降溫到25 ℃加入0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)24 h。離心收集菌體,超聲破碎后4 ℃、12 000 r/min離心所得上清液即為粗酶液,吸取適量粗酶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組酶的表達(dá)情況。

2.3 重組酶的純化

使用緩沖液(50 mmol/L PBS緩沖、pH 7.4)對(duì)鎳親和柱進(jìn)行預(yù)平衡,將粗酶液以2 mL/min的速度上樣平衡后的鎳親和柱,分別使用45和300 mmol/L的咪唑緩沖液進(jìn)行蛋白洗雜和洗脫,將洗脫液于透析袋中4 ℃透析8 h、重復(fù)3次得到不含咪唑的純酶溶液,加入50%(體積分?jǐn)?shù))純甘油于-20 ℃冷凍保存。

2.4 纖維二糖差向異構(gòu)酶酶活測定方法

酶活力單位(U)的定義：以乳糖為催化底物每分鐘生成1 μmoL乳果糖所需的纖維二糖差向異構(gòu)酶的酶量。

酶活力測定方法：取1 mL發(fā)酵液離心獲得菌體,用生理鹽水洗滌2次,再用1 mL 50 g/L乳糖溶液重懸菌體,置于80 ℃水浴反應(yīng)20 min,反應(yīng)結(jié)束后加入鹽酸終止反應(yīng),進(jìn)一步分析生成乳果糖的濃度。

檢測方法：采用GB 1886.176—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 異構(gòu)化乳糖液》中的HPLC高效液相色譜法以及顯色法來測定乳果糖的濃度。

顯色法：將樣品稀釋到適當(dāng)濃度,取100 μL樣品加入280 μL 70%的濃硫酸,置于46 ℃水浴中5 min,加入20 μL顯色劑,持續(xù)水浴50 min,測定518 nm的吸光值[16]。

2.5 NZ13-RE01 CE酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

最適反應(yīng)pH測定：測定pH為7～9條件下NZ13-CE酶的活性變化(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液),最高活性設(shè)定為100%,計(jì)算在不同pH條件下的相對(duì)酶活力。最適反應(yīng)溫度：測定反應(yīng)溫度在40～90 ℃范圍內(nèi)重組酶的酶活力,將測得最高酶活力設(shè)為100%,計(jì)算在其他溫度條件下的相對(duì)酶活力?；钚园胨テ冢褐亟M酶在最適反應(yīng)溫度下保溫0～240 min,結(jié)束后迅速加入鹽酸終止反應(yīng),測定殘余酶活力(Ut),以熱處理前的酶活力為初始酶活力(U0),計(jì)算該酶在最適反應(yīng)溫度下的活性半衰期[17]。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定：測定在不同底物濃度[S]下,NZ13-CE酶的催化速率v,并根據(jù)底物濃度[S]和催化速率v的雙倒數(shù)作圖,求得Km,Vmax,kcat等動(dòng)力學(xué)參數(shù)的數(shù)值。

2.6 通過大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)重組酶

以篩選出的相對(duì)高酶活克隆作為出發(fā)菌株E.coliBL21(DE3)pET-28a-NZ13-CE,在7.5 L發(fā)酵罐中嘗試高密度發(fā)酵和目的酶表達(dá)。前期設(shè)定培養(yǎng)溫度為37 ℃來快速生長菌體,參考裴緒澤和吳彬等[18-19]對(duì)高密度發(fā)酵大腸桿菌產(chǎn)酶的優(yōu)化策略,將溶解氧控制在20%～30%水平,通氣量5 L/min,發(fā)酵液pH 7.0,前期控制比生長速率為0.2 h-1,誘導(dǎo)后比生長速率控制為0.1 h-1。OD600達(dá)到40～50時(shí)降溫至25 ℃,加入IPTG開始誘導(dǎo),繼續(xù)發(fā)酵至OD600不再上升時(shí)停止補(bǔ)料并結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵過程中控制發(fā)酵液中的卡那霉素終質(zhì)量濃度為25 μg/mL,IPTG終濃度為 0.5 mmol/L,總發(fā)酵時(shí)間不超過30 h。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 NZ13-CE酶的一級(jí)序列分析

將NZ13-CE酶的一級(jí)序列與已發(fā)表的幾種產(chǎn)乳果糖CE酶進(jìn)行比較,包括C.saccharolyticus(CSCE)、Dictyoglomusturgidum(DTCE)、Caldicellulosiruptorobsidiansis(COCE)等來源。結(jié)果表明該酶和DTCE、COCE、CSCE的一致性分別為54.2%、51.5%和51.0%。這表明在已報(bào)道能產(chǎn)乳果糖的CE酶中,NZ13-CE的序列一致性相對(duì)較低,是比較新的酶家族成員。在保守殘基方面,CE酶家族的催化殘基H245和H373也存在于NZ13-CE(圖1)。

圖1 NZ13-CE酶和已報(bào)道其他CE酶的一級(jí)序列比對(duì)

3.2 表達(dá)載體pET-28a-NZ13CE的轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證

將構(gòu)建好的pET-28a-NZ13CE質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,由圖2-a可知PCR產(chǎn)物條帶約為1.2 kbp,與NZ13-CE編碼基因的片段大小一致,表明該表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建。

圖2 轉(zhuǎn)化克隆的PCR和SDS-PAGE電泳驗(yàn)證

將重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵與誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)束后離心取菌泥重懸于PBS緩沖液,超聲破碎30 min進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,由圖2-b可知在44 kDa附近有明顯的蛋白表達(dá)條帶,證明E.coliBL21(DE3)pET-28a-NZ13-CE表達(dá)宿主構(gòu)建成功。

3.3 不同陽性克隆表達(dá)NZ13-CE基因的酶活力差別驗(yàn)證

為研究不同陽性克隆表達(dá)酶活力的水平差異,用LB液體培養(yǎng)基對(duì)隨機(jī)挑取的10個(gè)陽性克隆進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)和酶表達(dá)。結(jié)果如圖3所示,表明不同克隆的酶活力差別較小,其中酶活力最高的#8號(hào)克隆為0.53 U/mL,最低的#7號(hào)克隆為0.46 U/mL,是前者的87%。該結(jié)果表明大腸桿菌BL21(DE3)菌株對(duì)NZ13-CE酶的表達(dá)穩(wěn)定性較好,選擇#8號(hào)克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 平板挑取不同重組克隆的表達(dá)酶活力比較

3.4 重組纖維二糖差向異構(gòu)酶的純化

由于克隆所選擇的pET-28a載體插入位點(diǎn)為NdeI和XhoI,使得重組酶N-端帶有his-tag組氨酸標(biāo)簽,進(jìn)而可利用鎳親和柱對(duì)其進(jìn)行高效的蛋白純化,在純化過程中收集各步驟所得樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。由圖4可知,泳道1為咪唑洗脫步驟收集的重組酶,從條帶可以看出此時(shí)酶濃度和純度均很高；泳道2為洗雜液洗出的較高濃度雜蛋白,表明雜蛋白得到了有效去除；泳道3為上樣后的穿透液；泳道4為上樣的細(xì)胞破碎離心上清液。洗脫所得目的蛋白在5 kDa分子質(zhì)量的透析袋內(nèi)透析3次去除咪唑,再添加甘油至終濃度50%(體積分?jǐn)?shù))于-20 ℃保存。

泳道M-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1-洗脫液；泳道2-洗雜液；泳道3-穿透液；泳道4-破碎離心上清液

3.5 重組NZ13-CE酶的全酶分子質(zhì)量測定

參考已發(fā)表文獻(xiàn),使用凝膠排阻色譜法[20]測定NZ13-CE重組酶的分子質(zhì)量,根據(jù)280 nm紫外吸收值監(jiān)測蛋白質(zhì)含量變化。由圖4可知,重組酶出峰體積為77.65 mL,根據(jù)測定不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品出峰時(shí)間得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-0.041 3X+7.864 9,其中X代表出峰體積(mL),Y代表蛋白質(zhì)總分子質(zhì)量(Da)的log值。將數(shù)據(jù)帶入計(jì)算得到NZ13-CE酶的分子質(zhì)量為45.5 kDa,接近理論分子質(zhì)量46.5 kDa,可知NZ13-CE酶為單亞基酶,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[12]。

a-重組酶的凝膠排阻色譜法出峰圖譜；b-凝膠排阻色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線以及重組酶分子質(zhì)量計(jì)算

3.6 重組NZ13-CE酶的酶學(xué)性質(zhì)

重組酶在不同溫度下的相對(duì)酶活如圖6-a所示,結(jié)果表明其最適反應(yīng)溫度為80 ℃,在70～85 ℃仍能保持80%以上的相對(duì)酶活力,當(dāng)溫度超過85 ℃后,酶活力急劇下降。重組NZ13-CE酶在不同pH條件下的酶活力如圖6-b所示,可見該酶對(duì)于極端pH的耐受力很弱。當(dāng)pH值為8.0時(shí)(緩沖液為Tris-HCl),其酶活力達(dá)到最高；隨著pH的增加,酶活力急劇降低,僅在pH值為7.5～8.0才能使得該酶保持80%以上的活性。這與已報(bào)道的其他CE酶較為相似,其原因可能是CE酶催化殘基為組氨酸,僅在中性條件下可同時(shí)作為質(zhì)子供(受)體,因此在其他pH條件下活性變差。由于80 ℃是NZ13-CE酶的最適反應(yīng)溫度,因此繼續(xù)研究80 ℃下的活力半衰期。由圖7-a可知,ln(Ut/U0)數(shù)值和保溫時(shí)間t可擬合成線性關(guān)系,線性方程為ln(Ut/U0)=-0.003 84t+0.003 91,當(dāng)Ut/U0為0.5時(shí),計(jì)算得到半衰期t1/2為181.5 min。由于異構(gòu)酶均存在可逆反應(yīng)平衡的特征,因此纖維二糖差向異構(gòu)酶同樣存在反應(yīng)平衡限制。使用過量酶與底物反應(yīng)足夠長的時(shí)間即可得到對(duì)乳糖至乳果糖的最高轉(zhuǎn)化率。由圖7-b可知,重組酶對(duì)這一反應(yīng)的最高轉(zhuǎn)化率為52.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。進(jìn)一步通過HPLC分析了反應(yīng)產(chǎn)物中各組分的比例,由峰面積比較(圖8)可知,副產(chǎn)物依匹乳糖含量為總糖含量的9.2%；該數(shù)值低于已報(bào)道的CE酶,表明NZ13-CE酶形成依匹乳糖的能力較弱,有利于減少最終產(chǎn)品中依匹乳糖的含量。

a-NZ13-CE重組酶的最適反應(yīng)溫度；b-NZ13-CE重組酶的最適反應(yīng)pH

圖8 酶催化產(chǎn)物的HPLC圖譜分析

最后測定了NZ13-CE酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),雙倒數(shù)法求得方程Y=1 021.93X+1.77(R2=0.99),其中Y為1/v,X為1/[S]；結(jié)果表明其Km值為577.4 mmol/L,kcat值為12 150 min-1,Vmax值為0.565 mmol/(L·s)。以上數(shù)據(jù)與已報(bào)道的CE酶相比具有優(yōu)勢,例如轉(zhuǎn)換數(shù)kcat值僅低于C.obsidiansis(14 004 min-1)和D.thermophilum來源(26 484 min-1)[12]；而其催化效率kcat/Km值為21.0 L/(min·mmol),遠(yuǎn)高于C.saccharolyticus來源(CSCE),后者僅為4.2 L/(min·mmol)[15]。

3.7 E.coli BL21(DE3)-NZ13菌株的高密度發(fā)酵與基因表達(dá)

將E.coliBL21(DE3)作為NZ13-CE酶高密度發(fā)酵用菌株,總發(fā)酵周期為27 h,具體過程：37 ℃培養(yǎng)5 h,在重組大腸桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后降溫至25 ℃開始誘導(dǎo),添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,加入IPTG后重組酶開始表達(dá)；同時(shí)進(jìn)行流加補(bǔ)料,菌濃度逐漸上升并測得了酶活力不斷提高。為模擬實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中更加嚴(yán)苛的客觀條件,對(duì)7.5 L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量進(jìn)行限制,分別為最高800 r/min和5 L/min。發(fā)現(xiàn)在第5 h,誘導(dǎo)時(shí)溶氧僅有3%左右,低溶氧限制了菌體的快速生長,因此需要更長的發(fā)酵周期。OD600在27 h時(shí)停止上升達(dá)到81(DCW = 27.6 g/L),此時(shí)結(jié)束發(fā)酵并測得發(fā)酵液酶活力為4.30 U/mL。

4 討論

大腸桿菌是遺傳背景最為清晰的工程菌株之一,且生長速度快、蛋白表達(dá)能力強(qiáng)、易于高密度培養(yǎng)。盡管會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素,但現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過下游分離來去除[21]。本研究中將網(wǎng)團(tuán)菌屬Dictyoglomussp.NZ13-RE01來源的纖維二糖差向異構(gòu)酶在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),搖瓶酶活力為0.53 U/mL發(fā)酵液；該酶催化乳糖獲得乳果糖的最高轉(zhuǎn)化率為52.5%,而副產(chǎn)物依匹乳糖比例僅為9.2%。經(jīng)過27 h的高密度發(fā)酵,成功將發(fā)酵液酶活力提升到4.30 U/mL；反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明NZ13-CE酶具有相對(duì)較高的kcat值和kcat/Km值。盡管該酶活力仍有待提高,但未來可對(duì)NZ13-CE酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造,從而將其單酶活力進(jìn)一步提升,實(shí)現(xiàn)乳果糖的生物法制備。

5 結(jié)論

本研究首次將網(wǎng)團(tuán)菌屬Dictyoglomussp.NZ13-RE01菌株來源的CE酶編碼基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá),結(jié)果表明NZ13-CE重組酶的最適反應(yīng)溫度為80 ℃、最適反應(yīng)pH為8.0,重組酶分子質(zhì)量為45.5 kDa,在80 ℃下的活性半衰期為181.5 min,催化底物乳糖的最高轉(zhuǎn)化率為52.5%,重組菌株通過高密度發(fā)酵發(fā)酵液酶活可達(dá)4.3 U/mL,是搖瓶水平的8.1倍。