汪萌，朱麗霞，張旖旎，李舟，席青松，靳鐳

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430030)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術的出現(xiàn)為無數(shù)不孕癥夫婦帶來了福音。卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術通過將單個精子注射到成熟卵母細胞胞漿中，能有效解決男性因素引起的不孕癥，是輔助生殖領域具有重要意義的一項突破性技術[1]。雖然ICSI的操作流程已經(jīng)標準化，但是如何優(yōu)化卵母細胞脫顆粒到單精子注射時間，獲得更優(yōu)的妊娠結局仍需要進一步觀察和探索[2]。

傳統(tǒng)觀點認為由于脫顆粒過程中透明質酸酶以及機械吹打會損傷卵母細胞的細胞膜，在脫顆粒操作后卵母細胞需要一段時間來恢復膜結構的穩(wěn)定性[3]，因此在脫顆粒一段時間后進行單精子注射是合理的。此外，在單精子注射前培養(yǎng)卵母細胞可能會促使胞質進一步成熟，從而使卵母細胞完全激活，獲得正常發(fā)育的潛能，可能會提高胚胎的受精率和臨床妊娠率[4]。但也有研究表明脫顆粒到單精子注射的時間與ICSI受精率負相關[5]，隨著時間間隔的延長，ICSI的受精率也會逐漸下降，因此推薦單精子注射應當在脫顆粒后盡快完成。然而還有部分研究認為脫顆粒時間對胚胎發(fā)育以及臨床結局均無顯著影響[6-7]。

由于目前對于脫顆粒后多久進行單精子注射能夠獲得最優(yōu)結局尚未達成共識，因此本研究進行了一項回顧性研究，探索卵丘復合物脫顆粒到單精子注射時間對ICSI周期妊娠結局的影響，并試圖找到最佳的脫顆粒后ICSI操作時機以獲得最優(yōu)臨床結局。

資料與方法

一、研究設計及分組

1.研究對象：本研究為單中心回顧性研究。研究對象為2016年10月至2019年12月于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心第一次行ICSI治療的夫婦。

納入標準為：(1)新鮮采卵周期；(2)男方少、弱精子癥且精子優(yōu)化后密度仍小于5×106/ml；(3)女方無明顯異常或僅為輸卵管因素性不孕；(4)女方年齡<40歲；(5)女方采用標準改良長方案進行促排卵；(6)獲卵數(shù)多于4個；(7)男方手淫法取精。

排除標準：(1)供卵或供精周期；(2)男方手術取精(包括睪丸穿刺取精、附睪穿刺取精、顯微取精等)；(3)夫妻雙方任何一方患有乙肝、結核等感染性疾?。?4)胚胎植入前遺傳學檢測周期；(5)ICSI后受精失敗或低下的周期(受精率<25%)。

本研究已通過華中科技大學同濟醫(yī)學院倫理委員會審核批準。

2.研究對象分組：根據(jù)納入排除標準，本研究共納入3 827個ICSI周期的數(shù)據(jù)。將卵丘復合物脫顆粒到單精子注射的時間定義為T，按照四分位數(shù)分為T1(T≤120 min，n=1 303)、T2(120 min210 min，n=846)4組。分析比較各組間的受精率、胚胎發(fā)育情況和臨床妊娠結局。

二、診療回顧

1.促排卵方案和取卵：所納入的周期均采用標準的改良長方案進行促排卵。在取卵周期的月經(jīng)第2天注射長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達必佳，輝凌，德國)3.75 mg進行降調節(jié)，注射藥物30 d后進行激素水平檢測和經(jīng)陰道B超監(jiān)測，達到降調節(jié)標準后，使用重組FSH(rFSH，果納芬，默克雪蘭諾，德國)進行促排卵，并根據(jù)卵泡監(jiān)測的結果調整用藥劑量。當經(jīng)陰道B超監(jiān)測有2個或以上優(yōu)勢卵泡直徑大于18 mm時，肌肉注射重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道超聲下取卵。

2.卵丘復合物脫顆粒操作：配制80 U/ml的透明質酸酶，將卵丘復合物置于預熱好的透明質酸酶中，反復輕輕吹打，使顆粒細胞松散后，將卵母細胞移至G-MOPS plus緩沖液(Vitrolife，瑞典)中機械法繼續(xù)吹打去除卵丘顆粒細胞，直至完全去除顆粒細胞；再將去除了卵丘顆粒細胞的卵母細胞轉移到G1 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)。

3.ICSI操作：將優(yōu)化處理后的精子加到PVP溶液(Vitrolife，瑞典)中，調節(jié)操作針，在鏡下需選擇形態(tài)正常，特別是頭部形態(tài)正常的直線前向運動精子(長約60 μm，頭部呈卵圓形，長約4～5 μm)。將待注射的精子制動后，將制動的精子從尾部吸入注射針內；用顯微固定針固定卵子，使卵子極體位于12點或6點位置；將精子推至注射針尖端，于3點位置將注射針垂直穿透透明帶及卵子胞膜進入胞漿，回吸可見卵膜破裂，部分胞漿和精子回流，隨后將回吸的胞漿與精子一起緩慢注入卵母細胞，盡可能減少PVP的注入量，最后退出操作針。

4.胚胎培養(yǎng)及形態(tài)學評估：ICSI注射結束后的卵子在培養(yǎng)液中充分沖洗后移到預先平衡的G1 plus培養(yǎng)液中放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。授精后16～18 h(D1)在倒置顯微鏡下評估原核(pronuclei，PN)，能觀察到兩個原核(2PN)并在卵周隙中有兩個極體則說明正常受精，記錄各個卵子的PN數(shù)目。正常受精的卵子繼續(xù)培養(yǎng)至第3天(D3)，分別于D2、D3觀察并記錄胚胎的卵裂情況(包括卵裂球數(shù)目、形態(tài)、均勻程度、碎片情況)。第3天選擇優(yōu)質胚胎進行移植，剩余可利用胚胎轉移至G2 plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，優(yōu)質囊胚進行冷凍保存。

5.臨床結局[8-9]：本研究納入的所有移植周期均為D3新鮮胚胎移植周期。胚胎移植后14 d進行血清HCG檢測。胚胎移植5周后在超聲下能觀察到子宮內孕囊及活動胎心則定義為臨床妊娠；確認臨床妊娠后20周內失去胎心則定義為流產(chǎn)；生化妊娠定義為HCG陽性但B超未見孕囊及胎心搏動。

三、評估指標及定義

患者基線數(shù)據(jù)；IVF評估指標，包括獲卵數(shù)、MⅡ率、2PN率、多PN率和卵裂率；妊娠結局評估指標，包括生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和種植率。

各指數(shù)的計算方式如下：MⅡ卵率=MⅡ卵總數(shù)/獲卵數(shù)×100%；2PN率=D1出現(xiàn)2PN的卵總數(shù)/ MⅡ卵總數(shù)×100%；多PN率=D1出現(xiàn)多PN的卵總數(shù)/ MⅡ卵總數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎總數(shù)/D1出現(xiàn)PN的卵總數(shù)×100%；生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；種植率=孕囊個數(shù)/移植總胚胎數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、研究對象的臨床特征基線比較

本研究共納入2016年10月至2019年12月第1次于本中心行ICSI治療的3 827個周期。卵丘復合物脫顆粒到單精子注射時間T(min)的范圍為(0～450)min，呈偏態(tài)分布；眾數(shù)為120 min，中位數(shù)為160 min，四分位數(shù)分別為120 min、160 min和210 min。根據(jù)T值大小分為T1(T≤120 min)、T2(120 min210 min)4組。其中T1組1 303個周期，T2組641個周期，T3組1 037個周期，T4組846個周期。

納入的患者臨床特征包括年齡、體質量指數(shù)(BMI)、基礎FSH水平、基礎竇卵泡數(shù)、不孕年限及采卵到脫顆粒時間，各組間均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者臨床特征基線數(shù)據(jù)(-±s)

二、各組患者的ICSI結果比較

本研究比較了不同組患者的獲卵數(shù)、MⅡ率、正常受精率(2PN率)、多PN率以及卵裂率。各組間獲卵數(shù)以及卵裂率比較均無顯著差異(P>0.05)。隨著脫顆粒到單精子注射時間T的逐步延長，MⅡ率逐步升高，正常受精率也逐漸增加；其中T1組的MⅡ卵率相較于T4組顯著降低(P<0.05)，且T1組的2PN率相較于其他3組也顯著降低(P<0.05)。此外，隨著T時間的延長，多PN率也呈現(xiàn)上升趨勢，T3組相較于T1組的多PN率顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組患者ICSI結果比較[(-±s)，%]

三、各組患者的妊娠結局比較

本研究統(tǒng)計了新鮮移植周期的妊娠結局，主要妊娠結局包括生化妊娠率、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率。納入的3 827個ICSI周期中，共有2 427個周期進行了D3新鮮周期胚胎移植，其中T1組838個周期、T2組393個周期、T3組642個周期、T4組554個周期。各組在單周期移植胚胎數(shù)目上無顯著差異(P>0.05)，且生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)。但是T1組的種植率顯著高于T3組(P<0.05)(表3)，提示脫顆粒到單精子注射時間過長可能會影響胚胎的種植潛能。

表3 新鮮周期移植的臨床結局比較[(-±s)，%]

討 論

ICSI技術作為一種新型的體外受精技術主要用于男性因素不育或傳統(tǒng)IVF受精失敗患者。卵丘復合物脫顆粒以及單精子注射是ICSI操作中至關重要的步驟，對最終的臨床妊娠結局有著重要影響。但如何控制脫顆粒到單精子注射時間以獲得最優(yōu)臨床結局目前尚無統(tǒng)一定論。本研究回顧性分析了脫顆粒到單精子注射時間對ICSI周期妊娠結局的影響，結果發(fā)現(xiàn)卵丘復合物脫顆粒到單精子注射時間會影響胚胎的種植潛能，合理地把握ICSI操作時機有利于提高胚胎種植機會，優(yōu)化IVF助孕結局。

本研究根據(jù)脫顆粒到單精子注射時間間隔，將納入人群分為4組，主要評估指標為IVF結果以及臨床妊娠結局。IVF結果提示隨著脫顆粒到單精子注射時間間隔不斷延長，正常受精率(2PN率)也逐漸升高，這一結果與最近一項大樣本研究報道[3]一致，該研究中納入了1 468個ICSI周期，發(fā)現(xiàn)脫顆粒到單精子注射時間間隔與正常受精率之間存在正相關。造成這種現(xiàn)象的原因可能與卵母細胞的胞漿成熟相關。有文獻報道小鼠卵母細胞的核與胞漿的發(fā)育和成熟是不同步的，顆粒細胞會影響卵母細胞胞漿的成熟[10]，如果在卵母細胞胞漿成熟前進行ICSI，可能無法恢復減數(shù)分裂過程，從而無法形成原核導致受精失敗。然而，在正常生理條件下，排卵后的卵母細胞長時間不受精，卵母細胞的質量會呈現(xiàn)時間依賴性的下降，表現(xiàn)為“卵母細胞老化”，這也是造成IVF/ICSI周期中胚胎發(fā)育潛能下降的最常見原因之一[11-12]。本研究結果也提示，脫顆粒到單精子注射時間間隔越長，胚胎的異常受精率(多PN率)也會逐漸上升。異常受精率上升也是卵母細胞老化的一種表現(xiàn)，是由于老化的卵母細胞在進行分裂時染色體滯留增加所致[13]。因此脫顆粒到單精子注射時間間隔過長或過短均不利于胚胎的發(fā)育。此外，本研究結果發(fā)現(xiàn)隨著脫顆粒到單精子注射時間的延長，卵母細胞的MⅡ卵率也逐漸增加，這可能與單精子注射時間越晚，卵母細胞體外培養(yǎng)時間延長，部分處于MI期的卵母細胞可能在體外成熟，導致卵母細胞成熟率增高有關。

本研究將胚胎的妊娠結局作為主要結局指標，發(fā)現(xiàn)各組在生化妊娠率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率上并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。但有趣的是，雖然隨著脫顆粒到單精子注射時間間隔的延長，受精率逐漸升高，但是胚胎的種植率反而下降。原因可能正如前文所述，如果卵母細胞沒有在一個合適的時間段內受精，卵母細胞會繼續(xù)在輸卵管或者培養(yǎng)液中停留，從而發(fā)生卵母細胞老化最終影響卵母細胞的發(fā)育潛能[14]；老化的卵母細胞會影響卵母細胞成熟相關因子的表達，從而最終影響后期胚胎的發(fā)育與種植潛能[15]。

本研究根據(jù)脫顆粒到單精子注射時間間隔(T)的四分位數(shù)，將各組進行對比，結果發(fā)現(xiàn)相較于其他組，T1組(T≤120 min)的胚胎種植率顯著升高，提示如果控制此時間間隔在2 h以內，可能有助于胚胎的著床。時間間隔越長，胚胎的種植能力可能會受損。Boldi等[16]發(fā)現(xiàn)將時間間隔控制在1 h以內能獲得更高的優(yōu)質胚胎率、種植率和妊娠率。Zhang等[17]也發(fā)現(xiàn)將時間間隔控制在4 h以內會獲得更好的臨床妊娠率。雖然本研究結論與這些結果大體上一致，但是脫顆粒細胞后進行單精子注射的最佳時間各研究仍不統(tǒng)一。本研究的結果顯示在卵母細胞脫顆粒后孵育一段時間后應該盡快完成單精子注射操作，以獲得更好的妊娠結局。

本研究仍存在不足之處。首先本研究是一個單中心的回顧性研究，樣本量也有限；其次雖然各組移植胚胎數(shù)沒有顯著差異，但是單胚胎移植和雙胚胎移植的臨床結局可能會存在差異；另外本研究僅關注了脫顆粒到單精子注射這一段時間，而采卵到脫顆粒的時間也有可能對結果造成一定的影響。后續(xù)需要多中心、大樣本、前瞻性研究來驗證結果的準確性。

綜上所述，在ICSI周期中卵丘復合物脫顆粒到單精子注射時間可能會影響胚胎的種植潛能，合理地把握ICSI操作時機有利于提高胚胎種植機會，優(yōu)化IVF助孕結局。