丁夢(mèng)杰 張旭東 胡俊霞

作為臨床實(shí)踐中最常見的惡性腫瘤，85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。 非小細(xì)胞肺癌患者主要類型為腺癌，大細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌[2]。 由于非小細(xì)胞肺癌患者的臨床癥狀體征不明顯，大多數(shù)患者初次入院確診時(shí)處于晚期治療階段?，F(xiàn)階段，隨著醫(yī)學(xué)衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步與完善，肺癌分子生物學(xué)也在不停的發(fā)展，新藥不斷被研制應(yīng)用，然而晚期非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率仍然只有15%[3-5]。 故積極尋找治療非小細(xì)胞肺癌患者的新方法，探索有用的治療靶點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外臨床研究的熱門話題。相關(guān)研究[6-7]指出，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs的異常表達(dá)可能與人類疾病關(guān)聯(lián)，在腫瘤出現(xiàn)、增殖、侵入、遷移、耐藥和復(fù)發(fā)等過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，可能成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。目前，已經(jīng)闡明了一些LncRNA在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用，例如位于HOXC 12q13.13的HOTAIR對(duì)乳腺癌有重要影響[8]。 相較而言，關(guān)于lncRNA在人類肺癌分子生物學(xué)機(jī)制中的研究很少。本文檢測(cè)了lncRNA LINC00460在NSCLC患者癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況，旨在分析lncRNA LINC00460與患者臨床因素的關(guān)系及長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00460在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

使用回顧性調(diào)查法，選取2018年3月至2019年在我院收治的90例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象，根據(jù)lncRNA LINC00460在癌細(xì)胞組織中的表達(dá)水平，將高表達(dá)水平患者(≥8.45)設(shè)為觀察組(56例)，低表達(dá)水平患者(<8.45)設(shè)為對(duì)照組(34例)。觀察組男性39例，女性為17例，年齡為34～80歲，平均年齡為(57.48±8.72)歲。對(duì)照組男性21例，女性13例，年齡為32～81歲，平均年齡為(56.14±9.33)歲。2組患者均同意并接受手術(shù)治療。2組患者的臨床資料存在可比性(P>0.05)。本研究征得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：①所有患者經(jīng)手術(shù)治療，病理結(jié)果確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌；②術(shù)前未接受放化療及其他輔助治療；③患者無(wú)精神障礙，依從性良好，能夠配合。

排除標(biāo)準(zhǔn)[10]：①心肝腎等器官功能障礙，存在血液性疾病，急性感染，藥物過(guò)敏史；②合并其他惡性腫瘤；③臨床資料不全或中途退出者。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 試劑與儀器 由南京諾唯贊生物工程有限公合成lncRNA LINC00460引物；使用購(gòu)自ABI公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與RNA提取試劑盒；使用購(gòu)自TaKaRa公司STBR Premix Ex Taq試劑盒；使用購(gòu)自ABI公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自賽默飛公司實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)儀。

1.3.2 研究方法 (1)總RNA提?。和ㄟ^(guò)超聲處理使50 mg樣品組織均質(zhì)化，根據(jù)RNA提取試劑盒的說(shuō)明從組織中提取總RNA。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1 μmol/l逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μl，10×RT緩沖液1.5 μl 100 mmol/l dNTP0.1 5 μl，50 U/μl MultiScribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，20 U/μl RNase抑制劑0.19 μl，總RNA 1 μl，用DEPC水補(bǔ)至20 μl。 作用條件：在25 ℃反應(yīng)10 min，在37 ℃反應(yīng)60 min，在85 ℃反應(yīng)5 min，在4 ℃下儲(chǔ)存使用。(3)qPCR擴(kuò)增：嚴(yán)格按照STBR Premix Ex Taq試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作。 5'-ACAGCATGAGCCAGGA-CATC-3'為lncRNA LINC00460上游引物，5'-GAAAGCTGCAACAT-GCTCCC-3'為下游引物。 將以下試劑加入冰中：1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，1 μl引物，10 μl TaqManGEx MASTER Mix和20 μl雙蒸水。 作用條件：在95 ℃下預(yù)變性5 min，95 ℃15 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，總共40個(gè)循環(huán)。(4)數(shù)據(jù)處理：以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt值(lncRNA LINC00460)-2-ΔΔCt值(GAPDH)為lncRNA LINC00460相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本組研究數(shù)據(jù)經(jīng)整合后均采用 SPSS20.0 版進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用百分比(%)表示，用卡方或 Fisher 確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)；計(jì)量資料數(shù)據(jù)用表示，組間比較用t檢驗(yàn)，使用Cox多元素回歸模型分析 lncRNA 與非小細(xì)胞肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系，數(shù)據(jù)對(duì)比差異顯著且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用P<0.05 表示。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA LINC00460在非小細(xì)胞肺癌患者癌旁組織與癌組織中的表達(dá)水平

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，90例非小細(xì)胞肺癌患者中癌旁組織lncRNA LINC00460 的相對(duì)表達(dá)均值為(1.58±0.86)，低于癌組織的(8.54±3.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.836，P<0.05)。

2.2 非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征與lncRNA LINC00460表達(dá)的關(guān)系

2組患者的癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460表達(dá)水平在性別、年齡、病理分型、腫瘤直徑及血管侵犯方面進(jìn)行對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但2組患者的癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460表達(dá)水平在分化程度與有無(wú)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征與lncRNA LINC00460表達(dá)的關(guān)系/例

2.3 lncRNA LINC00460的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

觀察組56例患者lncRNA LINC00460平均表達(dá)水平為(5.63±1.96)；對(duì)照組34例患者lncRNA LINC00460平均表達(dá)水平為(10.17±3.14)。觀察組與對(duì)照組的無(wú)進(jìn)展生存率分別為(9.4±1.2)月與(18.9±2.1)月，2組對(duì)比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組與對(duì)照組的總生存期分別為(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，2組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 LINC00460的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系月)

2.4 非小細(xì)胞肺癌患者總生存期cox 回歸分析

單因素COX分析顯示，男性、腫瘤直徑、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LINC00460高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的危險(xiǎn)因素。多因素 COX 回歸模型顯示lncRNA LINC00460 高表達(dá)水平患者與非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期(HR = 2.31，95% CI：1.76 ～3.69，P= 0.013)相關(guān)，是其獨(dú)立預(yù)后影響因子，男性、腫瘤直徑、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者總生存期cox 回歸分析

3 討論

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率與死亡率居高不下，由于缺少高效的初始生物標(biāo)志物，早期臨床檢測(cè)率低，患者出現(xiàn)身體不適就診時(shí)處于晚期階段[11]。多數(shù)研究人員著手研究非小細(xì)胞肺癌患者的發(fā)病機(jī)制，但其機(jī)制尚未完全了解，治療效果不佳。 已有資料[12]報(bào)道，lncRNA在各種腫瘤的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，探索非小細(xì)胞肺癌患者的發(fā)病機(jī)制和治療方式已成為研究的熱點(diǎn)[13-14]。RNA測(cè)序及l(fā)ncRNAs微陣列等技術(shù)的發(fā)展和使用讓更多的非小細(xì)胞肺癌患者失調(diào)的lncRNA被發(fā)現(xiàn)[15-17]。以癌基因或腫瘤抑制基因參與癌癥進(jìn)展，lncRNAs是非小細(xì)胞肺癌患者診斷和臨床預(yù)后的治療靶點(diǎn)及重要生物標(biāo)志物[18-19]。

作為非編碼RNA，lncRNA不僅影響蛋白質(zhì)，還可以影響細(xì)胞自身的各種過(guò)程，例如細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)，劑量校正、DNA損傷與染色體印跡。MR-NA和miRNA結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致lncRNA的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，其調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程和mRNA穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，現(xiàn)階段，尚未有精確的機(jī)制[20-23]。lncRNA LINC01296介入肺癌的發(fā)展可能與特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要蛋白的轉(zhuǎn)錄或修飾相關(guān)。相關(guān)研究[24]指出，lncRNA LINC01296可能與PI3K-Akt-mTOR通路存在關(guān)聯(lián)，這是癌癥有關(guān)的主通路之一，在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重大作用。在本研究的早期階段，lncRNALINC00460在非小細(xì)胞肺癌癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，本文RT-qPCR結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460的表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)，與之前報(bào)道的基因芯片的結(jié)果相一致[25]。此外，本研究追蹤了觀察組和對(duì)照組患者無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期，結(jié)果顯示觀察組和對(duì)照組患者無(wú)進(jìn)展生存期分別為(9.4±1.2)月和(18.9±2.1)月，總生存期分別為(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明了lncRNALINC00460表達(dá)上調(diào)可能和患者預(yù)后不良關(guān)聯(lián)。 lncRNALINC00460表達(dá)下調(diào)一定程度上可改善患者臨床預(yù)后并延長(zhǎng)生存期。

本研究對(duì)lncRNA LINC00460表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者組織中患者病理學(xué)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、病理分型、腫瘤直徑及血管侵犯的非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00460相對(duì)表達(dá)對(duì)比差異不存統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，然而不同病理分級(jí)的lncRNALINC00460相對(duì)表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在與否有顯著性差異(P<0.05)。這表明非小細(xì)胞肺癌患者的病情惡化程度及l(fā)ncRNA LINC00460的表達(dá)水平正相關(guān)，lncRNA LINC00460可能介入了非小細(xì)胞肺癌患者的進(jìn)展，因此下調(diào)lncRNA LINC00460表達(dá)是臨床治療的新思路。

在多變量COX回歸分析中，lncRNALINC01296的高表達(dá)水平，男性，腫瘤直徑，血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。但該研究未收集有關(guān)術(shù)后接受放化療者的信息，可能對(duì)結(jié)果造成一定誤差。后期將擴(kuò)大樣本量，完善信息收集，進(jìn)一步研究lncRNALINC01296對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的臨床意義及作用機(jī)制。

綜上所述，lncRNA LINC00460的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織中上調(diào)，且影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后，是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。